Exosomes from BM-MSCs increase the population of CSCs via transfer of miR-142-3p

骨髓間充質(zhì)干/基質(zhì)細胞的外泌體轉(zhuǎn)移miR-142-3p增加結(jié)腸癌干細胞的數(shù)量

    期刊：Br. J. Cancer；影響因子：5.922

    發(fā)表單位：中國醫(yī)科大學

    骨髓間充質(zhì)干/基質(zhì)細胞（BM-MSCs）衍生的外泌體通過miR-142-3p促進結(jié)腸癌干細胞樣特性

    從BM-MSCs中分離外泌體，并使用這些外泌體來治療結(jié)腸癌細胞。通過細胞表面標記（CD133和Lgr5）和功能測定、基因靶標的功能和分子分析發(fā)現(xiàn)BM-MSC衍生的外泌體含有不同的microRNA，包括miR-142-3p，這反過來又增加了結(jié)腸癌細胞中CSCs的數(shù)量。從BM-MSC衍生的外泌體中敲低miR-142-3p明顯降低了結(jié)腸CSC的數(shù)量。機理上，發(fā)現(xiàn)Numb是miR-142-3p的靶基因，并且miR-142-3p通過下調(diào)Numb促進Notch信號傳導通路。

    骨髓間充質(zhì)干/基質(zhì)細胞（BM-MSCs）是顯示遷移至腫瘤并參與腫瘤微環(huán)境的祖細胞。BM-MSCs通過釋放細胞因子或外泌體在腫瘤過程中發(fā)揮重要作用;然而，BM-MSCs如何影響結(jié)腸癌細胞中CSC的干性仍然知之甚少。

    從健康個體獲得的人骨髓細胞中分離人BM-MSC。通過流式細胞儀評估的BM-MSC的純度>95％。貼壁細胞顯示出均勻的成纖維形態(tài)。在第6代（P6）BM-MSCs具有均一的表面標志物，并且對于間充質(zhì)標記物（CD44，CD73，CD90和CD105）呈陽性，對造血和內(nèi)皮標記物（CD34，CD11b，CD19，CD45）和HLA-DR呈陰性。P6 BM-MSC的純度約為87.4％。

    通過標準超速離心分離了源自BM-MSC的外泌體。通過粒度分析儀證明了BM-MSC衍生的外泌體的大小范圍為3.6-140nm。通過免疫電子顯微鏡確認外泌體對已知的外泌體標記CD63，CD81和RAb5A呈陽性。外泌體對CD63，CD81，Rab5A，CD9和HSP70的表達呈陽性，并且通過蛋白質(zhì)印跡對細胞色素c的表達呈陰性。

    用來自BM-MSC的條件培養(yǎng)基的外泌體處理結(jié)腸癌細胞。當用外泌體處理結(jié)腸癌細胞時，進行FCM發(fā)現(xiàn)CD133+和Lgr5+結(jié)腸癌細胞的表達水平增加，集落形成測定顯示集落數(shù)增加，結(jié)腸癌細胞中干細胞標志物的表達增加。細胞侵襲和致腫瘤性測定發(fā)現(xiàn)用外泌體處理的結(jié)腸癌細胞顯著增加細胞侵襲和致腫瘤性。BM-MSC衍生的外泌體也促進細胞粘附，對doxorubicin也表現(xiàn)出更大的抗藥性。表明，來自BM-MSCs的外泌體在促進結(jié)腸癌細胞的干性中起著關鍵作用。

    從microRNA陣列中，我們鑒定出50個microRNA，其中BM-MSCs衍生的外泌體增加了3倍以上。從50種microRNA中選擇了miR-142-3p，這是唯一一種促進結(jié)腸癌干細胞樣球形成和CD133和Lgr5表達的microRNA。使用定量實時PCR，我們證實來自用BM-MSC衍生的外泌體處理的結(jié)腸癌細胞的外泌體的miR-142-3p的豐度大于單獨的結(jié)腸癌細胞。

    用miR-142-3p慢病毒或?qū)φ章《巨D(zhuǎn)染三種結(jié)腸癌細胞發(fā)現(xiàn)用miR-142-3p轉(zhuǎn)染的三種癌細胞比用對照轉(zhuǎn)染的細胞具有更大比例的CD133和Lgr5陽性細胞。BM-MSC衍生的外泌體中結(jié)腸癌細胞中干細胞標志物的表達增加。原位注射小鼠腸壁實驗發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在體內(nèi)抑制HT-29和SW-480結(jié)腸癌細胞的原發(fā)性腫瘤中的腫瘤增殖。表明BM-MSC衍生的外泌體可能通過miR-142-3p促進腫瘤的進展。

    使用TargetScan來確定miR-142-3p靶基因并鑒定了與CSC信號傳導通路相關的幾種靶基因。通過生信分析，選擇Numb作為結(jié)腸癌中的miR-142-3p的的靶基因。雙熒光素酶報告基因測定顯示miR-142-3p的可以直接結(jié)合Numb的3'UTR，而突變體3'UTR沒有觀察到差異。定量實時PCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-142-3p的結(jié)腸癌細胞中的Numb表達顯著降低。蛋白質(zhì)印跡表明miR-142-3p轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞中Numb的豐度降低。此外，抑制Numb的表達促進的Notch靶基因表達，在miR-142-3p-過表達的結(jié)腸癌細胞中逆轉(zhuǎn)Numb也可以抑制Notch信號。

    使用antagomiR-142-3p，我們降低了BM-MSCs外泌體中miR-142-3p的表達。用來自antagomiR-142-3p轉(zhuǎn)染的BM-MSC或?qū)φ?/span>antagomiR轉(zhuǎn)染的BM-MSC的外泌體處理結(jié)腸癌細胞。結(jié)果顯示，antagomiR-142-3p可下調(diào)結(jié)腸CSCs的數(shù)量。與對照antagomiR相比，antagomiR-142-3p療法相對減少細胞侵襲和粘附。耐藥性測定顯示，與來自BM-MSC的外泌體相比，antagomiR-142-3p外泌體可顯著抑制結(jié)腸癌細胞的細胞活力。表明從BM-MSCs的外泌體中剝奪miR-142-3p可以減弱外泌體對結(jié)腸癌細胞的作用。

    總之，我們的工作揭示了BM-MSC衍生的外泌體調(diào)節(jié)結(jié)腸癌進展的能力爭論領域。這些數(shù)據(jù)闡明了BM-MSC衍生的外泌體通過miR-142-3p促進CSC表型的功能。我們的研究結(jié)果以及該領域的其他研究表明，BM-MSCs是更通用的細胞，通過細胞因子或外泌體對結(jié)腸CSCs表型，腫瘤形成，侵襲和化療耐藥性有貢獻。

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