Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma

環(huán)狀RNA cSMARCA5抑制肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

    期刊：J. Hepatol.；影響因子： 14.911

    發(fā)表單位：第二軍醫(yī)大學(xué)

    cSMARCA5通過(guò)miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

    體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明cSMARCA5抑制HCC細(xì)胞的增殖和遷移。從機(jī)理上講，cSMARCA5可以通過(guò)海綿吸附miR-17-3p和miR-181b-5p促進(jìn)TIMP3（一種眾所周知的腫瘤抑制因子）的表達(dá)。

    肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，過(guò)去的三十年中，英國(guó)的HCC發(fā)病率翻了一番，在美國(guó)翻了三倍。很大程度上是因?yàn)檗D(zhuǎn)移的傾向，5年HCC患者的存活率仍然很低，每年約有600,000名HCC患者死亡。確定轉(zhuǎn)移性HCC的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

    我們首先使用RNA-seq分析HCC組織和癌旁組織的RNA。共檢測(cè)到13,686個(gè)不同的circRNA，排除低豐度后，鑒定了4727個(gè)circRNA。其中4214個(gè)circRNA已包含在circBase中，其他513個(gè)是新的（圖1A）。此外，4142個(gè)circRNAs由來(lái)自2322個(gè)基因的蛋白質(zhì)編碼外顯子組成（圖1B），并且大多數(shù)外顯子circRNA的長(zhǎng)度小于1,000個(gè)核苷酸（圖1C）。對(duì)比HCC文庫(kù)及ANL文庫(kù)可知236個(gè)差異表達(dá)的circRNA中，在HCC中108個(gè)被上調(diào)，128個(gè)被下調(diào)（圖1D）。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)部分circRNA在40對(duì)HCC和ANL組織中的表達(dá)（圖1E），與RNA-seq結(jié)果一致。

    選擇cSMARCA5用于進(jìn)一步研究，因?yàn)樗?/span>是差異表達(dá)的豐富的circRNA之一，其在HCC中顯著下調(diào)，但其pre-mRNA、mRNA、蛋白水平上調(diào)，表明cSMARCA5在HCC中的較低表達(dá)不僅僅是剪接的副產(chǎn)物并且暗示了功能性，已證明其在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性傳播的早期具有至關(guān)重要的意義。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)證明cSMARCA5沒(méi)有poly-A尾。此外，cSMARCA5對(duì)RNaseR具有抗性。半衰期測(cè)量證明cSMARCA5比mSMARCA5更穩(wěn)定，qRT-PCR和熒光原位雜交（FISH）顯示cSMARCA5的主要細(xì)胞質(zhì)分布。

    構(gòu)建cSMARCA5野生型載體及兩端片段截?cái)噍d體，發(fā)現(xiàn)只有野生型載體能高表達(dá)cSMARCA5，這說(shuō)明了I14RC和I16RC對(duì)cSMARCA5的產(chǎn)生是不可或缺的。對(duì)RNA結(jié)合蛋白相關(guān)基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，在敲除DHX9后，cSMARCA5明顯上調(diào)，而pSMARCA5和mSMARCA5沒(méi)有顯示出顯著變化，并且這種效應(yīng)可以通過(guò)過(guò)表達(dá)野生型DHX9轉(zhuǎn)基因而不是'解旋酶死亡'突變體來(lái)挽救，表明調(diào)節(jié)依賴(lài)于其解旋酶活性。使用針對(duì)DHX9的抗體進(jìn)行了RNA免疫沉淀（RIP），并觀察到I14RC和I16RC的顯著富集。此外，DHX9在HCC中明顯上調(diào)并在HCC組織中與cSMARCA5的表達(dá)負(fù)相關(guān)。

    Kaplan-Meier的存活曲線顯示，肝癌切除術(shù)后肝癌患者cSMARCA5表達(dá)較低的HCC患者總體具有較低的生存率（OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存率（RFS）。多變量分析表明cSMARCA5表達(dá)水平，連同AFP，腫瘤大小，病理性衛(wèi)星，封裝，是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，cSMARCA5表達(dá)水平，與AFP，腫瘤大小，微血管入侵，封裝，是RFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

    CCK-8測(cè)定，劃痕傷口愈合和transwell遷移測(cè)定顯示過(guò)表達(dá)cSMARCA5后HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移顯著延遲。敲低cSMARCA5促進(jìn)了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。在體內(nèi)，裸鼠皮下注射cSMARCA5過(guò)表達(dá)細(xì)胞顯示腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。將皮下腫瘤組織原位植入的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)顯著更少的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。隨后，通過(guò)尾靜脈注射建立肺轉(zhuǎn)移模型使用體內(nèi)成像系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)cSMARCA5的過(guò)表達(dá)可顯著抑制肺轉(zhuǎn)移。

    用SMMC-7721和Huh7細(xì)胞中抗AGO2的抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP），cSMARCA5被AGO2抗體顯著富集。這一結(jié)果表明cSMARCA5可能作為一個(gè)AGO2和miRNA的結(jié)合平臺(tái)。使用miRanda miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)工具找到65個(gè)可能與cSMARCA5結(jié)合的潛在miRNA。其中29個(gè)在人HCC或ANL中表達(dá)，結(jié)合circRIP，使用特異性針對(duì)cSMARCA5的探針，發(fā)現(xiàn)cSMARCA5，miR-17-3p和miR-181b-5p的特異性富集。使用這兩種miRNA進(jìn)行熒光素酶測(cè)定、生物素偶聯(lián)的miR-17-3p或miR-181b-5p模擬物的下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)了他們之間的相互作用。此外，雙FISH（熒光原位雜交）測(cè)定表明cSMARCA5和這兩種miRNA的共定位。

    分別過(guò)表達(dá)miR-17-3p和miR-181b-5p模擬物，TIMP3都下調(diào)。cSMARCA5過(guò)表達(dá)時(shí)TIMP3是顯著上調(diào)，cSMARCA5敲低時(shí)最明顯地下調(diào)。我們觀察到外源miR-17-3p或（和）miR-181b-5p可顯著抑制TIMP3的表達(dá)，并且在cSMARCA5過(guò)表達(dá)后抑制被抑制。CCK-8測(cè)定、Transwell遷移測(cè)定顯示miR-17-3p或（和）miR-181b-5p可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且這種作用可以被過(guò)表達(dá)的cSMARCA5阻斷。此外，TIMP3的mRNA水平下調(diào)并且與HCC組織中cSMARCA5的表達(dá)正相關(guān)?？傊?，結(jié)果表明cSMARCA5至少部分地通過(guò)miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

    我們的研究表明，circRNA可能抑制HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并作為肝切除術(shù)后肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，在HCC中初步證實(shí)了DHX9-cSMARCA5-miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路的調(diào)節(jié)作用。我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步的肝癌中circRNA的功能，診斷和治療研究奠定了基礎(chǔ)。

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