Cervical squamous cell carcinoma-secreted exosomal miR-221-3p promotes lymphangiogenesis and lymphatic metastasis by targeting VASH1

宮頸鱗狀細胞癌分泌的外泌體miR-221-3p通過靶向VASH1促進淋巴管生成和淋巴轉移

    期刊：Oncogene ；影響因子： 6.854

    發(fā)表單位：廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院

    外泌體miR-221-3p通過靶向VASH1促進淋巴管生成和淋巴轉移

    我們發(fā)現(xiàn)miR-221-3p與CSCC的腫瘤周圍淋巴管生成和淋巴結（LN）轉移密切相關。miR-221-3p特征性地富集并通過CSCC分泌的外泌體轉移到人淋巴管內皮細胞（HLECs）中以促進體外HLECs遷移和管形成。

    宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）是最常見的惡性腫瘤之一，其在全世界女性惡性腫瘤中的發(fā)病率約為15％。超過20％的早期CSCC患者患有術后復發(fā)，主要是由于手術前發(fā)生淋巴轉移。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤周圍的淋巴管是腫瘤細胞從其原發(fā)部位向區(qū)域淋巴結（LN）傳播的高速公路。然而，腫瘤驅動的腫瘤周圍淋巴管生成的分子機制尚未明確定義。

    使用原位雜交（ISH）在107個石蠟包埋的人CSCC連續(xù)切片中檢查miR-221-3p水平。與LN陰性組相比，在LN陽性組的原發(fā)腫瘤部位檢測到顯著高水平的miR-221-3p。相應地，較高的miR-221-3p水平與CSCC標本連續(xù)切片中腫瘤周圍淋巴管密度（PLVD）的增加強烈相關。更重要的是，除腫瘤細胞外，一些腫瘤周圍淋巴管中也存在高miR-221-3p水平。表明高水平的miR-221-3p表達可促進淋巴管生成并促進CSCC中的淋巴轉移（注意：這個miRNA在TCGA宮頸癌中有的，去查一下，可以知道是否上調）。

    從Siha和Ect1細胞的上清液中純化外泌體。通過透射電子顯微鏡證實了典型的杯形形態(tài)和30-100nm的尺寸范圍。蛋白質印跡檢測包括CD63和CD81的外泌體陽性標記。熒光標記后用于共聚焦顯微鏡評估。受體HLEC細胞質內的綠色熒光標點信號表明外泌體內化。在用PKH67標記的外泌體孵育的MLEC中也觀察到相同的現(xiàn)象。用CSCC分泌的外泌體處理后，在受體HLEC和MLEC中觀察到miR-221-3p細胞水平的增加。

    將過表達miR-221-3p或陰性對照（NC）的慢病毒載體轉染到Ect1（低miR-221-3p）中，并將慢病毒載體沉默miR-221-3p或NC應用于Siha（高miR-221-3p）。定量qRT-PCR和增殖，遷移和管形成測定顯示，具有高miR-221-3p的外泌體顯著促進HLEC和MLEC遷移和管形成，表明外泌體miR-221-3p在體外促進淋巴管生成。有趣的是，HLECs和MLECs的增殖似乎不受miR-221-3p高或低的外泌體的影響。

    使用popliteal LN 轉移模型在體內評估外泌體miR-221-3p對CSCC淋巴管生成和淋巴轉移的影響。ISH和IHC分析表明在一些腫瘤周圍淋巴管中存在顯著更高水平的miR-221-3p，與從Ect1/miR-NC和Siha/anti-221-3p分泌的miR-221-3p低的那些相比較，腫瘤細胞處理的外泌體具有從Ect1/miR-221-3p和Siha/抗NC分泌的高水平miR-221-3p。在具有高外泌體miR-221-3p的組中，與具有低外泌體miR-221-3p的組相比，發(fā)現(xiàn)轉移陽性popliteal LN的比例更高。總之，這些結果表明CSCC分泌的外泌體miR-221-3p可以促進體內淋巴管生成和LN轉移。

    使用多種算法（miRWalk,PicTar和TargetScan）預測135個靶基因受miR-221-3p調節(jié)，血管抑制素-1（VASH1）作為由Gene Ontology Consortium證實的淋巴管生成的負調節(jié)劑起作用并且被選擇用于進一步研究。將VASH1（野生型）的3'-UTR中預測的miR-221-3p結合位點或突變序列（突變型）克隆到熒光素酶報告質粒中，評估他們對HLEC中miR-221-3p的反應得出VASH1是miR-221-3p的直接靶標。

    進一步的體外研究證實，VASH1的重新表達可以消除Ect1/miR-221-3p和Siha/抗NC外泌體介導的HLECs遷移和管形成的促進，而沉默VASH1可能引起Ect1/miR-NC和Siha/抗221-3p外泌體在HLEC中誘導遷移和管形成的能力?？傊?，這些結果表明外泌體miR-221-3p通過抑制HLEC中的VASH1表達誘導淋巴管生成。

    在I-II期CSCC患者（n=20）或無LN轉移的循環(huán)中分離并表征外泌體發(fā)現(xiàn)形態(tài)，大小范圍和相關蛋白質與來自條件培養(yǎng)基的那些一致。LN陽性患者中分離的循環(huán)外泌體miR-221-3p表達在循環(huán)中顯著高于LN陰性患者。HLECs發(fā)芽試驗結果顯示，來自LN陽性患者而非LN陰性患者的循環(huán)外泌體增加了HLEC的萌芽淋巴管生成，其可被miR-221-3p抑制劑消除。

    研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)外泌體miR-221-3p水平與腫瘤miR-221-3p水平和淋巴管生成呈正相關，但與VASH1表達呈負相關。人CSCC組織中的免疫熒光和ISH也證明腫瘤中的高miR-221-3p水平伴隨著LYVE1陽性淋巴管中VASH1表達降低和PLVD增強，即CSCC分泌的外泌體miR-221-3p通過下調HLEC中的VASH1表達促進淋巴管生成，然后促進淋巴轉移。

    總之，我們的數(shù)據(jù)提供了證據(jù)表明高水平的循環(huán)外泌體miR-221-3p在CSCC中與LN轉移相關并且與PLVD正相關。將CSCC分泌的外泌體miR-221-3p水平轉移到HLEC中可以通過調節(jié)VASH1信號傳導促進淋巴管生成，然后促進淋巴轉移。新發(fā)現(xiàn)的細胞間miR-221-3p-VASH1軸顯示了CSCC進展的關鍵分子機制，為CSCC患者LN轉移提供了新的診斷和治療靶點。

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