Twist1 Regulates Vimentin through Cul2 Circular RNA to Promote EMT in Hepatocellular Carcinoma

Twist1通過Cul2環(huán)狀RNA調(diào)節(jié)波形蛋白，促進肝細胞癌的EMT

    期刊：Cancer Res.；影響因子：9.13

    發(fā)表單位：南開大學(xué)

    circRNA機制研究中，轉(zhuǎn)錄因子 --> circRNA表達 --> 吸附miRNA --> 促進靶基因表達 --> 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本微文提供Twist所有潛在靶基因列表信息，可在文末回復(fù)下載。

    Twist是一種關(guān)鍵的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，可增加波形蛋白的表達。在這里，我們報道Twist1可以轉(zhuǎn)錄激活Cullin2（Cul2）環(huán)狀RNA的表達，進而吸收靶向波形蛋白的miRNA，以增加EMT中波形蛋白的表達。

    上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，并且涉及細胞重編程過程，其中上皮細胞顯著改變其形狀，表現(xiàn)出增加的運動性并獲得間充質(zhì)表型。有證據(jù)表明Twist1上調(diào)了EMT中波形蛋白的表達，但調(diào)控機制尚不清楚，波形蛋白啟動子上沒有確定的Twist1結(jié)合位點。

    通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）進行深度測序（ChIP-seq）發(fā)現(xiàn)Twist1直接與Cul2啟動子結(jié)合。雙熒光素酶報告系統(tǒng)來檢測到Twist1能夠激活Cul2啟動子的活性。分析75個HCC組織樣品后發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性HCC組織中Cul2的表達沒有顯著差異。在circRNADb上預(yù)測了幾個circRNA并在轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性HCC組織中檢查了7種circRNA的表達。發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)移性HCC相比，轉(zhuǎn)移性HCC中來源于Cul2基因的circ-10720表達持續(xù)且顯著增加。circ-10720表達水平隨著381個HCC組織中臨床分期和病理分級的進展而增加。Kaplan-Meier存活曲線顯示，circ-10720表達升高表明HCC患者的存活率較低。（注意：此處為什么選擇Cul2基因的circ?單純的circRNA 要預(yù)測其功能是極其困難的，我們可以假設(shè)重要基因來源的circRNA同樣會有重要的功能。Cul2是多種ECS（ElonginB/C-CUL2/5-SOCS-box蛋白）E3泛素-蛋白連接酶復(fù)合物的核心成分，其介導(dǎo)靶蛋白的泛素化。）

    Cul2位于染色體10中，并且circ-10720由外顯子6至外顯子12產(chǎn)生。在Twist1過表達的PLC細胞中circ-10720的表達增加，在Twist1敲低的SMMC-7721細胞中表達降低。設(shè)計靶向circ-10720的反向剪接序列的siRNA，使用掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在circ-10720過表達的PLC細胞中，細胞偽足增加并且細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)表型，而在circ-10720耗盡后SMMC-7721細胞變?yōu)樯掀蛹毎?/span>。此外，我們發(fā)現(xiàn)circ-10720促進了PLC細胞的增殖，遷移和侵襲，并且circ-10720敲低抑制了細胞遷移和侵襲?？傊?/span>Twist1促進了circ-10720表達，并且circ-10720在HCC細胞中起著致癌作用（注意：circ的表達依然受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而且與其來源基因所受的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控或許一致，可以因此尋找上調(diào)調(diào)控因子）。

    在CircInteractome數(shù)據(jù)庫中進行了背景評分百分位篩選出14種miRNA。使用熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)相應(yīng)的靶位點在熒光素酶報告基因中突變時，用miRNA轉(zhuǎn)染對熒光素酶活性沒有顯著影響，表明circ-10720可以作為這些miRNA的海綿起作用。進行功能喪失測定、Western印跡以及免疫熒光分析檢查Twist介導(dǎo)的波形蛋白調(diào)節(jié)是否通過circRNA發(fā)生，結(jié)果顯示Twist1增強了波形蛋白表達水平，而在Twist1過表達PLC細胞中circ-10720敲低抵消了Twist1對波形蛋白表達的促進作用。此外，circ-10720敲低抵消了由Twist1過表達誘導(dǎo)的增強的細胞增殖，遷移和侵襲。

    建立PDTX模型，使用qRT-PCR檢測來自HCC患者的腫瘤組織中的Twist1表達水平，分為Twist1-Low和Twist-High組。Twist1-Low組的一半小鼠腫瘤內(nèi)注射攜帶circ-10720的慢病毒顆粒，Twist1-High組的一半小鼠腫瘤內(nèi)注射si-circ-10720。Twist1-Low腫瘤中circ-10720的過度表達增加了腫瘤體積。在Twist1-High腫瘤中敲低circ-10720阻斷了Twist1對腫瘤生長的促進作用。高Twist1表達水平顯著增加波形蛋白表達水平，但circ-10720敲低抵消了Twist1對波形蛋白表達的促進作用。

    用DEN處理TetOn-Twist1小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生HCC，然后將所有發(fā)生HCC的小鼠隨機分成兩組。一組喂無doxycycline水，第二組喂有doxycycline水(Twis1t組) ，促進Twist1表達（Twist組）。7天后，Twist1組中的一半小鼠通過靜脈注射（Twi+si-circ-10720組）用si-circ-10720處理，另一半用siRNA對照處理（Twi+siRNA）。測定小鼠肝臟表面上的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。結(jié)果顯示doxycycline處理的小鼠顯示出顯著增加的腫瘤數(shù)量，并且注射si-circ-10720的小鼠顯示出抵消結(jié)果。在Twi+siRNA ctrl組中，Twist1和波形蛋白在肝腫瘤組織中的表達水平增加，而circ-10720敲低阻斷了Twist1對波形蛋白在Twi+si-circ-10720組中的影響。

    使用FISH分析了381個HCC樣本的circ-10720表達水平，相關(guān)性分析顯示circ-10720和波形蛋白的表達水平正相關(guān)（r=0.439，P=0.000）。Kaplan-Meier分析顯示，在75例HCC患者中，circ-10720/波形蛋白的陽性表達與較短的總體存活率相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)circ-10720表達水平與HCC病例臨床分期或病理分級之間的正相關(guān)。高circ-10720組中AFP水平顯著高于低circ-10720組。表明circ-10720與預(yù)后不良和腫瘤進展相關(guān)，并且它可能作為HCC的潛在生物標(biāo)志物。

    我們的數(shù)據(jù)揭示了Twist1對circ-10720介導(dǎo)的波形蛋白的調(diào)節(jié)以及在EMT期間circRNA的重要作用。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于開發(fā)基于circRNA的惡性癌癥診斷和治療策略。

    本文研究了轉(zhuǎn)錄因子Twist1對Cul2的調(diào)控作用，Twist1更多靶基因預(yù)測列表，可按下列方式回復(fù)獲取。

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