Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis

FBXW7環(huán)狀RNA在抑制膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生中的新作用

    期刊：J. Natl. Cancer Inst.；影響因子：11.238

    發(fā)表單位：中山大學附屬第一醫(yī)院

    circRNA翻譯蛋白質(zhì)，并抑制腫瘤進展。

    circ-FBXW7在正常人腦中大量表達。circ-FBXW7編碼一種新的21kDa蛋白質(zhì)：FBXW7-185aa。FBXW7-185aa在癌細胞中的上調(diào)抑制了增殖和細胞周期加速，而FBXW7-185aa的敲低在體外和體內(nèi)促進了惡性表型。FBXW7-185aa通過拮抗USP28誘導的c-Myc穩(wěn)定化來降低c-Myc的半衰期。

    環(huán)狀RNA（circRNA）是在真核基因組中廣泛存在的RNA轉(zhuǎn)錄物。近期的證據(jù)表明，circRNA在組織發(fā)育，基因調(diào)控和癌發(fā)生中起重要作用。然而，盡管近期報道了幾種circRNA的翻譯，但是circRNA是否編碼功能性蛋白仍然是難以捉摸的。

    我們對來自10對臨床膠質(zhì)母細胞瘤組織及其癌旁組織混樣成1個腫瘤組織、1個癌旁組織，進行了circRNA-seq分析，然后進行find_circ鑒定circRNAs，并與circBase數(shù)據(jù)庫比對。我們接下來使用RefSeq數(shù)據(jù)庫注釋這些已識別的候選者。鑒定的circRNA的染色體分布在癌組和正常組之間沒有顯著差異，而癌組中circRNA的總表達被下調(diào)。我們專注于在癌組和正常組之間具有大的差異表達的候選物，并將它們與circRNADb匹配。在這些特異性候選物中，由FBXW7基因的外顯子3和外顯子4的環(huán)化形成的novel_circ_022705引起了我們的注意。

    設(shè)計收斂和發(fā)散引物，其特異性擴增FBXW7的經(jīng)典或反向拼接形式，驗證了FBXW7基因的外顯子3和4形成內(nèi)源性circRNA。接下來，使用Sanger測序確認circ-FBXW7連接。我們發(fā)現(xiàn)反向拼接形成620 nt circ-FBXW7而不是Circbase中報道的1227 nt circ-FBXW7，很可能是由于內(nèi)含子序列剪切。合成的circRNA表達載體成功過表達circ-FBXW7，由剪接受體（SA）和供體（SD）的側(cè)翼重復序列誘導，對于缺乏下游側(cè)翼序列的對照載體未觀察到。利用FISH分析進行circ-FBXW7細胞定位，不同細胞組分的q-PCR分析證實circ-FBXW7主要位于細胞質(zhì)中（注意：此處發(fā)現(xiàn)該circ與circbase的不一致，測序得到的circ長度與circbase不一致時，要好好實驗確認，circbase的結(jié)果是軟件導出的，未經(jīng)實驗驗證的）。

    在circ-FBXW7中存在潛在的跨越連接ORF，5'-帽獨立翻譯需要內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）。使用雙熒光素酶載體系統(tǒng)驗證了circ-FBXW7中潛在的IRES活性，表明circ-FBXW7 IRES可以誘導5'-帽獨立翻譯。隨后建立一組載體以確認circ-FBXW7可在人體細胞中翻譯，并在陽性對照中添加FLAG標簽。FLAG標簽抗體僅在circ-FBXW7-FLAG-和FBXW7-FLAG-轉(zhuǎn)染的細胞中檢測到約22kDa蛋白質(zhì)，表明circ-FBXW7-FLAG載體被翻譯。然后使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進一步表明該新蛋白（FBXW7-185aa）由circ-FBXW7編碼。

    建立穩(wěn)定的circ-FBXW7過表達U251和U373細胞，其中IRES序列突變但載體可以與circ-FBXW7形成相似的circRNA的IRES突變載體用作陰性對照。與其對照細胞相比，穩(wěn)定過表達U251和U373細胞的Circ-FBXW7和FBXW7-FLAG表現(xiàn)出大量G1期阻滯，并且存活率降低。特異性shRNA敲低circ-FBXW7降低了FBXW7-185aa的表達，增加了細胞周期加速和細胞活力。表明FBXW7-185aa，但不是circ-FBXW7，可誘導細胞周期停滯并減少膠質(zhì)瘤細胞的增殖。

    我們發(fā)現(xiàn)c-Myc的表達在circ-FBXW7-和FBXW7-185aa-過表達細胞中也降低，半衰期測試表明FBXW7-185aa可以使c-Myc去穩(wěn)定化。體內(nèi)和體外泛素化測定顯示FBXW7-185aa過表達拮抗USP28誘導的c-Myc的去泛素化和增加的c-Myc遍在蛋白化。然而在Hs683和SW1783細胞中，如果FBXW7α被敲低，FBXW7-185aa的過表達不能降低c-Myc，表明FBXW7-185aa通過FBXW7α調(diào)節(jié)c-Myc。表明FBXW7-185aa與USP28競爭性地相互作用并“釋放”FBXW7α以降解c-Myc（注意：關(guān)聯(lián)重要轉(zhuǎn)錄因子Myc)。

    在38對組織中，膠質(zhì)母細胞瘤組織中circ-FBXW7表達與配對的相鄰非癌組織相比較低。同時，與低circ-FBXW7表達的患者相比，具有更高表達的膠質(zhì)母細胞瘤患者（38名患者中的8名，21.1％）具有增加的總存活時間。與對照細胞相比，穩(wěn)定過表達U251和U373細胞的circ-FBXW7表現(xiàn)出低得多的致腫瘤性。此外，穩(wěn)定過表達U251和U373細胞植入小鼠的circ-FBXW7比對照小鼠壽命更長（每組5只小鼠）。

    該研究僅限于培養(yǎng)細胞和異種移植動物模型。circ-FBXW7和FBXW7-185aa的臨床意義也可能需要通過更多實驗得到解決。此外，雖然腫瘤抑制作用是確定的，但FBXW7-185aa的臨床應(yīng)用還有很長的路要走。

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