Circular RNA VMA21 protects against intervertebral disc degeneration through targeting miR-200c and X linked inhibitor-of-apoptosis protein

環(huán)狀RNA VMA21通過靶向miR-200c和X連鎖的凋亡抑制蛋白來預防椎間盤退變

    期刊：ANN RHEUM DIS；影響因子：12.350

    發(fā)表單位：上海第九人民醫(yī)院

    上一篇微文“從miRNA入手尋找ceRNA機制分子circ/lncRNA”，我們介紹了通過miRNA尋找重要circ/lncRNA形成ceRNA機制的思路。本研究同樣從miRNA數(shù)據(jù)入手，下游預測其結(jié)合的基因XIAP，上游預測結(jié)合的circRNA形成ceRNA機制。純生信預測是容易的，而如何從眾多預測出來的分子中找到那個重要的分子的過程是艱辛的。

    通過對患者和大鼠模型的髓核（NP）細胞和退行性NP組織的進行的一系列實驗發(fā)現(xiàn)了miR-200c通過抑制XIAP調(diào)節(jié)NP細胞活力和功能。circVMA21充當miR-200c的海綿，通過靶向miR-200c和XIAP在NP細胞中起作用。

    腰痛是一種常見疾病，也是全球殘疾的主要原因，其主要發(fā)病原因是椎間盤（IVD）變性。椎間盤由內(nèi)髓核（NP）組成，并由纖維環(huán)包圍。多種異常刺激可增加NP中炎性細胞因子的水平，進而誘導NPC的合成代謝和分解代謝活性失衡，以及過度的NPC凋亡。這些不利因素引發(fā)或加速椎間盤退變（IVDD）。因此，有必要找到一種有效的方法來抑制NPC凋亡，減弱炎癥反應，并逆轉(zhuǎn)NP微環(huán)境中合成代謝和分解代謝之間的不平衡。

    使用從NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫（GSE45856）獲得的微陣列數(shù)據(jù)研究退化NP組織中miRNA的差異表達。miRNA芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在退行性NP組織中14個miRNA上調(diào)，miR-200c具有最高水平的上調(diào)（圖1B），結(jié)果通過qRT-PCR測定、Northern印跡共同證實（圖1D）。miR-200c過表達細胞（圖1E）顯示凋亡細胞百分比增加（圖1F），胱天蛋白酶激活增加，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4和ADAMTS-5表達增加，以及膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖表達減少（圖1G）。表明miR-200c在NPC中具有促凋亡和促進代謝作用。IL-1β和TNF-α的治療增加了NPC中的miR-200c水平，其可被miR-200c拮抗劑抑制（圖1H）。敲低miR-200c，TNF-α和IL-1β的增強的細胞凋亡和細胞外基質(zhì)（ECM）代謝反應的變化被顯著抑制（圖1I，J）。因此，功能喪失和功能獲得實驗支持miR-200c在負調(diào)節(jié)NPC存活和功能中的關(guān)鍵作用（注意：GEO已有芯片數(shù)據(jù)分析尋找重要的miRNA miR-200c，而后過表達證實功能。需要芯片/測序數(shù)據(jù)分析挖掘的可以聯(lián)系我們）。

    基因本體論（GO）分析揭示了退行性NP組織中上調(diào)的miRNA與凋亡信號傳導通路的調(diào)節(jié)之間的相關(guān)性。生信分析預測凋亡通路調(diào)節(jié)因子XIAP是miR-200c的靶基因。熒光素酶實驗證實二者相互作用。與對照相比，在退行性NP組織中觀察到XIAP表達的降低。升高的miR-200c水平降低了XIAP表達，而內(nèi)源性miR-200c的敲低增加了NPC中的XIAP表達。XIAP敲低誘導NPC凋亡，加劇了分解代謝反應并降低了ECM組合物的表達。此外，缺乏XIAP顯著抵消了miR-200c拮抗劑在用TNF-α和IL-1β處理的NPC中的作用，表明miR-200c通過XIAP發(fā)揮其功能（注意：生信分析預測miR-200c的靶基因，而后qPCR證實二者表達呈負相關(guān)，熒光素直接證實二者作用。需要預測miRNA/lnc/circ/mRNA之間靶標關(guān)系可以聯(lián)系我們）。

    通過starBase預測與miR-200c結(jié)合的circRNA，根據(jù)clipreadNum分數(shù)篩選了前20個。通過qRT-PCR分析使用特異性引物檢測NP樣品中所選circRNA的存在。在NP組織中驗證了circVMA21的預測剪接點。使用不同引物的擴增產(chǎn)物通過測序根據(jù)circVMA21的序列確認。通過qRT-PCR分析，與對照相比，退行性NP組織中的CircVMA21水平顯著降低。該結(jié)果也通過RNA熒光原位雜交（FISH）證實。在退行性NP組織中，circVMA21水平與XIAP水平正相關(guān)。使用RNAhybrid將circVMA21的序列與miR-200c的序列進行比較，注意到circVMA21含有miR-200c的六個推定的靶位點。其中，通過熒光素酶測定驗證了五個位點。與mRNA相比，該circRNA豐富且對RNase R處理具有抗性。Northern印跡分析顯示線性VMA21可通過線性探針檢測，但不能在剪接位點內(nèi)檢測到圓形探針。Pull down測定顯示，與引入miR-200c突變相比，miR-200c捕獲的級分中的circVMA21更富集。考慮到所有因素，我們的結(jié)果表明circVMA21能夠直接結(jié)合NPC中的miR-200c。（注意：starBase 預測miR-200c結(jié)合的circRNA，RNAhybrid進一步分析結(jié)合位點）。

    NPC被攜帶circVMA21，線性VMA21，circVMA21 siRNA或?qū)φ誷iRNA的構(gòu)建的腺病毒感染。qRT-PCR和Northern印跡分析證實circVMA21的敲低或過表達。circVMA21的上調(diào)增加XIAP的表達，而circVMA21敲低誘導XIAP表達的減少。circVMA21的上調(diào)抵消了miR-200c對XIAP表達和活性的抑制作用。表明circVMA21充當miR-200c的功能性海綿以調(diào)節(jié)XIAP表達和活性。此外，將circVMA21和XIAP siRNA共轉(zhuǎn)染到NPC中，circVMA21對NPC活力和功能的積極作用減弱。（注意：將circRNA-miRNA-mRNA經(jīng)典的通路機制聯(lián)系起來）。

    通過針刺建立IVDD大鼠模型。在穿刺后1周和5周，使用33號細針將腺病毒人circVMA21注射到穿刺的IVD中。在第1,5和9周時獲得的X射線顯示在所有IVD穿刺組中隨時間變化的進行性椎間隙變窄。在注射后9周，在circVMA21組中IVD的MRI變性得分顯著低于非注射組。體內(nèi)RNA FISH發(fā)現(xiàn)位于NP區(qū)域的circVMA21。注射腺病毒circVMA21后，退行性NP組織中circVMA21水平顯著升高，而miR-200c水平降低。注射腺病毒circVMA21緩解了NP的退行性變化（注意：動物模型體內(nèi)驗證）。

    在這項研究中，我們首先將miR-200c鑒定為參與IVDD的關(guān)鍵miRNA。miR-200c參與了促凋亡反應和合成代謝因子和分解代謝因子的不平衡表達。然后，我們研究了circRNA對NPC中miR-200c調(diào)節(jié)功能的潛在影響。結(jié)果顯示，circVMA21通過捕獲并顯著降低miR-200c的活性并抑制其功能。因此，提出了一種機制，其中circVMA21輔助miR-200c抑制NPC凋亡，促進ECM合成代謝并抑制ECM分解代謝，從而延緩IVDD的進展。

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