Identification of ceRNA network based on a RNA?seq shows prognostic lncRNA biomarkers in human lung adenocarcinoma

基于RNA-seq鑒定ceRNA網(wǎng)絡(luò)顯示人肺腺癌中預(yù)后的lncRNA生物標(biāo)志物

    期刊：ONCOLOGY LETTERS

    發(fā)表單位：廣州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合學(xué)院

    lnc/circRNA功能的一個(gè)重要機(jī)制是通過(guò)ceRNA結(jié)合miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)。通過(guò)高通量測(cè)序或者芯片我們可以找到幾百上千個(gè)差異表達(dá)的lnc/circRNA、mRNA、miRNA。每個(gè)分子都可能通過(guò)該機(jī)制發(fā)揮作用。構(gòu)建所有重要分子的ceRNA網(wǎng)絡(luò)有助于發(fā)現(xiàn)重要分子，網(wǎng)絡(luò)中連接越多的分子，功能越重要。該如何構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)呢，以本文為例進(jìn)行介紹。

    據(jù)報(bào)道，lncRNA用作競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA或miRNA海綿，通過(guò)在致瘤過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)共同的miRNA來(lái)抑制miRNA反應(yīng)元件（MRE）與mRNA交換。

    通過(guò)單變量回歸和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，32個(gè)基因與LUAD的存活相關(guān)。使用Miranda預(yù)測(cè)結(jié)合這些lncRNA的前27種mRNA靶向miRNA。接下來(lái)，將這些靶miRNA轉(zhuǎn)移至TarBase，miRTarBase，miRecards和starBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得其靶基因。根據(jù)先前的miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA數(shù)據(jù)，基于29個(gè)預(yù)后mRNA建立了三個(gè)lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng)絡(luò)，在LUAD中形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

TCGA數(shù)據(jù)集和差異表達(dá)基因的分析

    TCGA網(wǎng)站獲得包含512個(gè)LUAD和58個(gè)癌旁組織樣品RNA-Seq數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：1）組織學(xué)診斷不是LUAD；2）存在除LUAD之外的惡性腫瘤; 3）患者樣本缺乏完整的分析數(shù)據(jù)。

    本研究共納入493名LUAD患者。癌旁組織58個(gè)。此外，有170名LUAD患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，323名LUAD患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。381名I-II級(jí)LUAD患者和112名III-IV級(jí)LUAD患者。

    將lncRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為RPM。過(guò)濾低表達(dá)基因后，與GENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)相比，LUAD RNA-Seq數(shù)據(jù)包含20,321個(gè)mRNA和181個(gè)lncRNA。接下來(lái)，使用EdgeR和R的DEseq包（Padj<0.05且絕對(duì)log2FC>1）計(jì)數(shù)差異表達(dá)的lncRNA。使用兩種方法取交集得到最終的lncRNA。(注意：TCGA包含miRNA/lncRNA/mRNA表達(dá)譜信息，很適合構(gòu)建三者間的ceRNA。構(gòu)建好網(wǎng)絡(luò)后，挑選可靠分子進(jìn)行ceRNA深入機(jī)制研究。如需各種腫瘤的ceRNA分析，可以聯(lián)系我們)。

ceRNA的網(wǎng)絡(luò)分析

    lncRNAs可以與miRNA結(jié)合并影響ceRNA功能。MiRanda用于預(yù)測(cè)lncRNA和miRNA之間的相互作用。miRanda主要基于circRNA和miRNA自由能量大小的組合：自由能越小，結(jié)合能力越強(qiáng)。在應(yīng)用閾值最大能量≤-20且得分>160的過(guò)濾后，預(yù)測(cè)了許多與lncRNA結(jié)合的miRNA，但僅研究了具有前10個(gè)得分的miRNA（注意：本文先對(duì)臨床資料做關(guān)聯(lián)分析篩選到了29種重要mRNA和3種lncRNA。預(yù)測(cè)后篩選前10個(gè)miRNA。實(shí)際預(yù)測(cè)時(shí)很容易預(yù)測(cè)上百個(gè)miRNA。數(shù)據(jù)龐大。）。

    基于TarBase，miRTarBase，miRecards和starBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了關(guān)于ceRNA網(wǎng)絡(luò)中microRNA的下游靶基因的信息。Cytoscape軟件用于構(gòu)建microRNA-target和microRNA-lncRNA整合網(wǎng)絡(luò)。

    提取20,502個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，并使用R語(yǔ)言（EdegR和DESeq）計(jì)算表達(dá)數(shù)據(jù)。選擇差異表達(dá)的基因（n=6280;表I）以進(jìn)一步研究它們的預(yù)后值（圖1）。

    Miranda預(yù)測(cè)了與三種lncRNA結(jié)合的microRNA，并且在閾值處獲得了712種miRNA。根據(jù)預(yù)測(cè)的分?jǐn)?shù)，本研究集中于27個(gè)miRNA，其中10個(gè)最高分（包括重復(fù)分?jǐn)?shù)）與每個(gè)lncRNA結(jié)合。構(gòu)建了包含715個(gè)節(jié)點(diǎn)和815個(gè)邊緣的miRNA和lncRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖5）。

    基于TarBase，miRTarBase，miRecards和starBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得上述27個(gè)關(guān)鍵miRNA的靶基因，構(gòu)建microRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含1,961個(gè)邊線，27個(gè)microRNA和1,229個(gè)mRNA（816個(gè)上調(diào)，413個(gè)下調(diào)；圖6）。此外，進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)中mRNA的GO BP富集分析（圖7）。

    miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA對(duì)用于構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網(wǎng)絡(luò)。分別提取29個(gè)先前的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)mRNA及其微小RNA，并建立調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)還添加了lncRNAs，其調(diào)節(jié)潛在的miRNA，并構(gòu)建了重要的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（圖8）。如所證明的，hsa-miR-619-5p與三種預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子具有調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)。三種上調(diào)的mRNA和一種下調(diào)的mRNA可能受到lncRNA-ceRNA網(wǎng)絡(luò)的影響。

    構(gòu)建ceRNA機(jī)制網(wǎng)絡(luò)需要至少三種分子lncRNA-miRNA-mRNA或circRNA-miRNA-mRNA。測(cè)序/芯片得到的差異表達(dá)的lnc/circRNA和mRNA比較多。除了考慮差異表達(dá)外，最好同時(shí)考慮其他因素對(duì)分子進(jìn)行精簡(jiǎn)。比如本文考慮Cox多因素分析、KM生存分析、WGCNA分子間相關(guān)性等，同時(shí)考慮多軟件預(yù)測(cè)取交集，預(yù)測(cè)后取得分值top10的分子。得到網(wǎng)絡(luò)后，即可整體了解重要的分子（也就是節(jié)點(diǎn)較多的分子），進(jìn)而挑選進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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