CircNT5E acts as a sponge of microRNA-422a to promote glioblastoma tumorigenesis

CircNT5E充當microRNA-422a的海綿，以促進膠質(zhì)母細胞瘤的腫瘤發(fā)生

    期刊：Cancer Research；影響因子：9.130

    發(fā)表單位：創(chuàng)傷性腦損傷與神經(jīng)病學(xué)研究所

    之前我們介紹了circRNA作為海綿吸附miRNA發(fā)揮作用如《circRNA過表達可以抑制HCC（ceRNA機制）》、《circRNA過表達可以導(dǎo)致心肌死亡（ceRNA機制）》、《circRNA可用作miRNA海綿促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移（IF: 9.130）》，本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細胞瘤中circNT5E可以海綿吸附miR-422a，通過影響miR-422a-NT5E、SOX4和PI3KCA通路促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖，遷移和侵襲等。

    我們確定了miR-422a下調(diào)的膠質(zhì)母細胞瘤組織中特異性增加的circRNA和lncRNA的子集。表征了來自NT5E的circRNA，命名為circNT5E。circNT5E控制多種病理過程，包括細胞增殖，遷移和侵襲。circNT5E直接結(jié)合miR-422a并抑制miR-422a活性。

    膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是眾所周知的中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)侵襲性惡性腦腫瘤，也是人類最致命的致癌形式之一。在最大可行的手術(shù)切除后，接受放療和替莫唑胺化療的患者顯示平均總生存期約為15個月。因此，GBM迫切需要新的治療方法，特別是那些靶向復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方法。

    首先，我們分析3對GBM組織樣品證實MiR-422a表達低于正常腦組織，然后進行微陣列（circRNA，lncRNA和mRNA）測定，qRT-PCR驗證。圖1A顯示了不同染色體中上調(diào)和下調(diào)的circRNA，lncRNA和mRNA的概述。548個circRNA/lncRNA上調(diào)。篩選miR-422a調(diào)節(jié)的ceRNA的流程如圖1C。結(jié)合陣列數(shù)據(jù)，TargetScan預(yù)測，得到355個circRNAs/lncRNAs可作為miR-422a海綿。具有miR-422a的兩個或更多個靶位點鑒定了38個circRNA/lncRNA。我們通過使用生物素-miRNA下拉法測試這38個circRNA/lncRNA。qRT-PCR結(jié)果顯示8個lncRNA和8個circRNA具有良好的特異性和重復(fù)性。如圖1D所示，與對照組相比，hsa_circ_0077232顯示出高倍數(shù)變化。因此，我們選擇了hsa_circ_0077232進行進一步分析（注意：本研究關(guān)注MiR-422a的ceRNA機制分子，為了獲得分子，先用芯片/測序篩選差異表達的circ/lncRNA，而后軟件預(yù)測，取可信度高的（超過兩個結(jié)合位點），miRNA pulldown驗證結(jié)合的分子。我們通常是先做測序篩選分子，而后預(yù)測結(jié)合的miRNA。本研究從相反角度尋找，思路新穎，值得學(xué)習。同時我們可以想像重要的miRNA極有可能通過ceRNA結(jié)合lnc/circ發(fā)揮作用的）。

    hsa_circ_0077232（circNT5E）位于染色體6中，長度為2,950個堿基對（bp），由來自NE5E基因組的7個外顯子（外顯子3-9）組成。Sanger測序證實circNT5E的RT-PCR產(chǎn)物中的頭對尾剪接具有預(yù)期的大?。▓D1G）。用RNase R消化抗性證實該RNA種類是環(huán)狀的（圖1I）。FISH證明circNT5E優(yōu)先定位于細胞質(zhì)中（圖1J）。

    我們使用FISH檢測觀察到隨著臨床分期的增加，circNT5E的表達水平顯著增加，同時qRT-PCR測定顯示，腫瘤組織中circNT5E表達顯著高于正常組織。表明circNT5E在膠質(zhì)瘤中起著致癌基因的作用。我們選擇U87（circNT5E低表達）和U251（circNT5E高表達）細胞系進行分析。構(gòu)建慢病毒載體circNT5E（LV-circNT5E），LV載體，LV-si-circNT5E和LV雜亂，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。qRT-PCR分析顯示，在U87-circNT5E穩(wěn)定細胞系中，circNT5E增加了99.04倍，而與對照細胞系相比，在U251-si-circNT5E穩(wěn)定細胞系中circNT5E減少了77％。circNT5E的上調(diào)顯著促進U87細胞的生長，增殖，侵襲和遷移，抑制細胞凋亡。同時circNT5E的敲低顯著抑制U251細胞生長，增殖，侵襲和遷移并促進細胞凋亡。

    我們進一步研究了circNT5E對體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤生長的影響。與LV-載體組相比，在LV-circNT5E組中觀察到腫瘤大小和重量增加。IHC染色顯示，circNT5E增加了基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9和EGFR的表達。此外，與LV-scrambled組相比，在LV-si-circNT5E組中觀察到腫瘤尺寸和重量減少。通過circNT5E敲低抑制MMP-9和EGFR?？傊Y(jié)果證明circNT5E有效地促進體內(nèi)GBM腫瘤形成。

    在許多先前的研究中已經(jīng)鑒定出有助于circRNA生物發(fā)生的蛋白質(zhì)因子，例如Quaking，RNA結(jié)合基序蛋白20和RNA編輯酶ADAR。然而，在GBM進展中導(dǎo)致circRNA生物發(fā)生的因素尚不清楚。我們專注于RNA結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)特定的富含腦的RNA編輯酶ADARB2在GBM組織中被下調(diào)（圖5A）。在我們的臨床樣本實驗中，發(fā)現(xiàn)GBM組織中的ADARB2 mRNA低于正常腦組織（圖5B）。然而，出乎意料地，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，GBM組織中ADARB2的蛋白質(zhì)水平高于正常腦組織（圖5C）。IHC結(jié)果還證實，ADARB2的蛋白質(zhì)表達水平在腫瘤組織中高于ANT（圖5D）。我們構(gòu)建了ADARB2過表達質(zhì)粒。結(jié)果顯示，在具有ADARB2異位表達的U87細胞中，circNT5E的表達水平上調(diào)，而線性NT5E mRNA下調(diào)（圖5G和H）。這些結(jié)果表明ADARB2參與GBM中circNT5E的生物合成。（注意：此處實驗發(fā)現(xiàn)mRNA水平與蛋白質(zhì)水平成相反的趨勢，有時候發(fā)現(xiàn)mRNA與蛋白質(zhì)表達不一致或許也是可以理解的）。

    我們確定在ceRNA篩選試驗中可以通過生物素-miR-422a下調(diào)circNT5E。其次，我們搜索了circRNADB，這是一個帶有蛋白質(zhì)編碼注釋的人類環(huán)狀RNA的綜合數(shù)據(jù)庫，沒有發(fā)現(xiàn)circNT5E的結(jié)果。第三，circNT5E在GBM細胞的細胞質(zhì)中豐富且穩(wěn)定?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們預(yù)測長度為2,950 bp的circNT5E可作為miRNA的結(jié)合平臺，而不僅僅是miR-422a。正如TargetScan 6.2和PubMed搜索“miRNA [AND]膠質(zhì)母細胞瘤”所預(yù)測的那樣，我們發(fā)現(xiàn)20個與circNT5E相關(guān)的miRNA的結(jié)合位點（圖6A）。幾乎所有miRNA都是先前已描述的GBM相關(guān)腫瘤抑制劑。熒光素酶基因?qū)嶒烇@示15種miRNA，特別是miR-422a，表現(xiàn)出下調(diào)的表達（圖6B）。這些結(jié)果表明circNT5E直接結(jié)合miR-422a并抑制其活性。

    我們通過充當miR-422a的海綿進一步檢查了circNT5E是否作為致癌基因起作用。構(gòu)建過表達敲低細胞。結(jié)果表明，miR-422a逆轉(zhuǎn)了circNT5E對細胞活力，增殖，侵襲和遷移的促進作用以及circNT5E對GBM細胞凋亡的抑制作用。基于這些結(jié)果，circNT5E至少部分地通過miR-422a影響GBM細胞的增殖，凋亡，侵襲和遷移能力。此外，我們通過蛋白質(zhì)印跡分析驗證了circNT5E/miR-422a調(diào)節(jié)軸對其下游信號傳導(dǎo)通路的影響。結(jié)果表明，circNT5E在處理的GBM細胞中上調(diào)NT5E，SOX4，PI3KCA，p-Akt和p-Smad2水平，而circNT5E敲低下調(diào)NT5E，SOX4，PI3KCA，p-Akt和p-Smad2水平（注意：qPCR，WB驗證那些基因？驗證靶基因）。此外，我們還通過miR-124證實了circNT5E調(diào)節(jié)的CDK4和AURKA。總之，ADARB2蛋白過表達可逆轉(zhuǎn)ADAR1誘導(dǎo)的circNT5E抑制，其通過調(diào)節(jié)miR-422a-NT5E，SOX4和PI3KCA信號傳導(dǎo)通路影響GBM細胞的存活，增殖，遷移和侵襲。（注意：如何關(guān)聯(lián)通路？驗證通路重要的基因，基因變化了，通路就影響了）。

    本研究的主要發(fā)現(xiàn)如下：（1）我們確定了GBM腫瘤發(fā)生中的circRNA/lncRNA表達譜。（2）篩選顯示miR-422a的海綿，circNT5E，其調(diào)節(jié)GBM細胞增殖，侵襲和遷移。（3）我們表征并功能評估了circNT5E是否由NT5E基因組形成并由RNA編輯酶ADARB2調(diào)節(jié)。（4）我們的研究結(jié)果表明，circNT5E通過海綿GBM抑制因子miRNA發(fā)揮額外的調(diào)節(jié)功能?？傊?，這些結(jié)果為開發(fā)GBM的新型治療方法提供了見解。

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