Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression

circRNA MTO1作為miRNA海綿與miR-9結(jié)合抑制肝癌進(jìn)展

    期刊：Hepatology；影響因子：11.711

    發(fā)表單位：浙江醫(yī)科大學(xué)

    circMTO1通過(guò)作為miR-9的海綿來(lái)促進(jìn)p21表達(dá)以抑制HCC進(jìn)展。

    我們分析了人類(lèi)circRNA在人類(lèi)肝細(xì)胞癌（HCC）組織中的表達(dá)譜，并鑒定circMTO1作為在HCC組織中顯著下調(diào)的一種circRNA。具有低circMTO1表達(dá)的HCC患者存活期縮短。通過(guò)使用生物素標(biāo)記的circMTO1探針在HCC細(xì)胞中進(jìn)行RNA體內(nèi)沉淀，我們將miR-9鑒定為circMTO1相關(guān)的miRNA。此外，HCC中circMTO1的沉默可以下調(diào)致癌miR-9的靶標(biāo)p21，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲。

    肝細(xì)胞癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，尤其是在中國(guó)。只有30％至40％的HCC患者使用與治愈性切除術(shù)，部分原因是癥狀晚期出現(xiàn)，并且由于轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的頻率高，這些HCC患者的預(yù)后仍然較差。這些挑戰(zhàn)使得迫切需要識(shí)別用于預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物標(biāo)志物并找到設(shè)計(jì)更強(qiáng)大治療方法的新靶標(biāo)。在過(guò)去十年中，已發(fā)現(xiàn)許多非編碼RNA在HCC患者中失調(diào)，在臨床中具有潛在應(yīng)用。然而，HCC中circRNA的表達(dá)譜，功能和失調(diào)仍有待鑒定。

    使用CircRNA microArray分析了7對(duì)HCC組織樣品，得到HCC和非腫瘤肝組織的circRNA表達(dá)譜。接下來(lái)，選擇10個(gè)上調(diào)和10個(gè)下調(diào)最顯著的circRNA在21個(gè)患者樣本中進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)circMTO1表達(dá)持續(xù)且顯著降低，然后在另外261例HCC患者中得到了驗(yàn)證。與匹配的非腫瘤組織相比，在87.4％HCC組織中circMTO1表達(dá)顯著降低。雖然一些circRNAs在HCC組織中減少，初步結(jié)果顯示對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，并且只有circMTO1的沉默對(duì)促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖具有顯著作用。取116名HCC患者的樣本進(jìn)行原位雜交分析確定circMTO1表達(dá)，與癌旁組織相比，HCC組織中的circMTO1表達(dá)也顯著降低，并且生存曲線顯示circMTO1低表達(dá)與HCC患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。

    通過(guò)MiRanda計(jì)劃預(yù)測(cè)，99個(gè)miRNA被預(yù)測(cè)為的目標(biāo)，然后篩選了表達(dá)和功能與HCC有關(guān)的20種circRNA，通過(guò)RIP circMTO1下拉實(shí)驗(yàn)，我們純化了circMTO1相關(guān)RNA并分析了該復(fù)合物中的20種候選miRNA。與對(duì)照相比，circMTO1和miR-9的特異性富集，而其他miRNA沒(méi)有富集，確定miR-9是HCC細(xì)胞中與circMTO1相關(guān)的miRNA。通過(guò)在HCC腫瘤和對(duì)照組中的FISH分析，我們發(fā)現(xiàn)circMTO1與細(xì)胞質(zhì)中的miR-9共定位，并且與匹配的非腫瘤組織相比，這種共定位在腫瘤中降低。

    構(gòu)建siRNA，其覆蓋了circMTO1的背面剪接區(qū)域以進(jìn)行沉默并通過(guò)qPCR確認(rèn)沉默效率。circMTO1同種型2和MTO1 mRNA的表達(dá)沒(méi)有顯示出顯著變化，證實(shí)了circMTO1沉默的特異性。此外還構(gòu)建了circMTO1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。circMTO1沉默顯著促進(jìn)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和減少凋亡，而circMTO1過(guò)表達(dá)促進(jìn)QGY-7701和SK-Hep1 HCC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。檢測(cè)了miR-9表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circMTO1對(duì)miR-9的表達(dá)水平?jīng)]有影響。因此，這些結(jié)果表明circMTO1可能通過(guò)海綿活性降低miR-9的致癌作用來(lái)抑制HCC進(jìn)展。

    circMTO1的沉默或miR-9模擬物的轉(zhuǎn)染均顯著降低HCC細(xì)胞中p21的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外，circMTO1的過(guò)表達(dá)可以增加QGY-7701和SK-Hep1 HCC細(xì)胞中p21的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在沉默circMTO1后，miR-9抑制劑可顯著降低p21 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的下調(diào)。更重要的是，miR-9抑制劑顯著阻斷了HCC細(xì)胞的circMTO1沉默介導(dǎo)的促進(jìn)增殖和細(xì)胞凋亡的抑制。因此，miR-9抑制劑可以阻斷circMTO1沉默的HCC促進(jìn)作用。結(jié)果表明circMTO1為miR-9的海綿，通過(guò)circMTO1/miR-9/p21軸消除miR-9致癌作用抑制HCC進(jìn)展。

    通過(guò)移植人HCC組織在裸鼠中形成皮下腫瘤并持續(xù)皮下傳代來(lái)制備攜帶HCC的裸鼠（SMMC-LTNM）。連續(xù)瘤內(nèi)注射膽固醇綴合的circMTO1 siRNA 2周后，我們發(fā)現(xiàn)在攜帶HCC的SMMC-LTNM小鼠中腫瘤生長(zhǎng)顯著加速并且血清AFP顯著增加。在腫瘤內(nèi)注射膽固醇綴合的circMTO1 siRNA后48小時(shí)，SMMC-LTNM小鼠的腫瘤組織中circMTO1和p21的表達(dá)顯著降低。此外，p21和下游CDK2表達(dá)被體內(nèi)circMTO1敲低抑制，而細(xì)胞侵襲和增殖標(biāo)志物MMP2和PCNA被上調(diào)。因此，這些結(jié)果證明circMTO1可以抑制體內(nèi)HCC進(jìn)展。

    總之，我們的研究結(jié)果表明，HCC中circMTO1表達(dá)顯著降低，并與HCC患者預(yù)后不良相關(guān)。功能和機(jī)制上，circMTO1通過(guò)對(duì)miR-9的海綿活性上調(diào)p21表達(dá)抑制HCC生長(zhǎng)，表明其在HCC發(fā)展中的腫瘤抑制作用。此外，circMTO1的體內(nèi)干預(yù)表明其在HCC靶向治療中的潛力。

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