Cells respond to deletion of CAV1 by increasing synthesis of extracellular matrix

細胞通過增加細胞外基質(zhì)的合成來響應(yīng)CAV1的缺失

    期刊：PLoS ONE；發(fā)表單位：英國劍橋醫(yī)學研究委員會分子生物學實驗室

    許多老師做過RNAseq、芯片實驗，通過分析得到了許多數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)該怎么看，怎么使用，在文章中該怎么寫，或許是許多老師所疑惑的。我們將通過文獻對RNAseq中涉及的各種分析，各種圖表進行解讀，以供老師在數(shù)據(jù)分析及文章撰寫時參考。一起來看看本篇RNAseq實驗怎么使用的這個數(shù)據(jù)吧！

    一系列細胞功能歸因于細胞膜穴樣內(nèi)陷，即質(zhì)膜的燒瓶狀內(nèi)陷。caveolin 1敲除引起穴樣內(nèi)陷消失，在這里，我們使用RNA-seq技術(shù)對caveolin 1敲除小鼠的原代胚胎成纖維細胞和正常對照進行基因表達譜分析，從而洞察細胞對細胞膜穴樣內(nèi)陷的缺失作出的反應(yīng)。與對照相比時，GO富集分析term“細胞外基質(zhì)”相關(guān)基因顯著高表達。

    RNA-seq材料：WT、CAV1-/-小鼠分離胚胎細胞，每組4個重復。

    RNA-seq 實驗：按照說明書（TruSeq Stranded mRNA LT，Illumina）制備測序文庫。簡而言之，將3'末端腺苷酸化，連接銜接子，并在兩端用銜接子對DNA片段進行PCR富集。使用KAPA Library Quantification試劑盒（Roche）在Applied Biosystem Vii7儀器中通過定量驗證文庫，并且質(zhì)量控制是使用Agilent Bioanalyzer和Agilent DNA array完成。將索引文庫歸一化并合并，并使用HiSeq平臺（Illumina）進行測序，進行單端50bp reads。

   RNA-seq數(shù)據(jù)處理和分析：通過TopHat2 v2.0.13將reads與GRCm38小鼠轉(zhuǎn)錄組（-nocoverage-search，-library-type=fr-firststrand，-transcriptome-index）對齊。Cufflinks套件v2.2.1（-library-type=fr-firststrand，-frag-bias-correct，-m-read-correct）用于量化轉(zhuǎn)錄本，q<0.05篩選差異表達的基因。

    測序reads比對到39707個基因上，16420個（41％）被定義為“表達”，其表達水平FPKM>1.0。在表達的基因中，我們發(fā)現(xiàn)103個蛋白質(zhì)編碼基因顯著差異表達（q<0.05）。WT和CAV1-/-MEF組顯著差異表達的基因顯示在表1和2中。

    Panther基因分類系統(tǒng)（www.pantherdb.org）對基因的亞細胞定位進行分類（圖1A）（注：此處是常用的GO富集中“細胞組分(cellular component)”，用的軟件不同而已）。

    所有差異進行GO富集分析細胞組分顯著富集到是蛋白質(zhì)性細胞外基質(zhì)“proteinaceous extracellular matrix”，細胞外區(qū)域“extracellular region”和細胞外空間“extracellular space”。當僅分析CAV1-/-MEF上調(diào)的基因時，蛋白質(zhì)性細胞外基質(zhì)“proteinaceous extracellular matrix”，細胞連接“cell junction”，細胞外基質(zhì)“extracellular matrix”，細胞外區(qū)域“extracellular region”和細胞外空間“extracellular space”顯著富集到，實際上這些術(shù)語包含了46個上調(diào)基因中的22個（圖1B）。當僅分析下調(diào)的基因時，具有較少的明顯整體模式，盡管具有術(shù)語中間絲細胞“intermediate filament”，骨架“cytoskeleton”的基因被過度表達（圖1C）。因此，我們的RNA-seq分析得出的一個明確結(jié)論是細胞外基質(zhì)（ECM）成分的基因在CAV1-/-MEF中上調(diào)。

    本研究主要查看細胞膜穴樣內(nèi)陷消失后哪些基因發(fā)生了差異表達，并且明確這些差異表達的基因位于細胞的哪個位置。通過RNAseq實驗可以篩選差異表達的基因，通過GO富集分析可以了解基因顯著富集的位置，當然GO富集分析可以知道差異基因顯著富集的分子功能（Molecular Function）、生物過程（Biological Process），此文章沒有用到，沒有寫出。文章展示RNAseq的數(shù)據(jù)，放置了基因差異表達列表（也可以放熱圖嘛）和GO富集分析經(jīng)典的柱狀圖，以說明穴樣內(nèi)陷消失引起分子層面基因的變化，以及基因富集到細胞外基質(zhì)，文章還通過qPCR, WB, 免疫組化等對重要基因進行了驗證。

    上海生因生物專業(yè)提供基因組測序、微生物測序、轉(zhuǎn)錄組測序（RNAseq），高通量測序數(shù)據(jù)標準分析、個性化分析，各類圖表繪制，及GEO、TCGA數(shù)據(jù)挖掘服務(wù)。有需要的聯(lián)系我們。

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