RNA-Seq profiling of circular RNAs in human laryngeal squamous cell carcinomas

RNAseq技術(shù)研究人喉鱗狀細(xì)胞癌circRNA表達(dá)譜

    期刊：Mol Cancer 影響因子：6.204分

    發(fā)表單位：北京友誼醫(yī)院

1 摘要

    許多腫瘤曾報(bào)道過非編碼circRNAs的異常表達(dá)。越來越多的研究顯示circRNAs可能會(huì)成為一個(gè)極好的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究的目的是評(píng)估人喉鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱LSCC）circRNA表達(dá)譜。LSCC樣品均由手術(shù)獲得，使用二代測(cè)序研究circRNA表達(dá)譜，對(duì)10例LSCC樣品進(jìn)行測(cè)序，其中2個(gè)高分化，3個(gè)中分化，另5個(gè)是對(duì)應(yīng)癌旁樣品。共鑒定到21444個(gè)circRNAs, 異常表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)是q-value < 0.001, foldchange > 2.0或<0.5。在癌組織中，29個(gè)circRNA顯著上調(diào)，19個(gè)circRNA顯著下調(diào)。對(duì)癌旁-高分化，癌旁-中分化取交集，上調(diào)下調(diào)的circRNAs分別是18、5個(gè)。另外，我們對(duì)circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)20個(gè)異常表達(dá)的circRNAs與一些與癌癥相關(guān)miRNAs結(jié)合。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，密切相關(guān)通路有PPAR（過氧化物酶體增殖物激活受體通路），Axon guidance（軸突導(dǎo)向信號(hào)通路）, Wnt，Cell cycle通路。circRNA hsa_circ:chr20:31876585-31897648能夠區(qū)分大部分的LSCC癌與癌旁組織。本研究表明，circRNAs具體作為L(zhǎng)SCC標(biāo)志物的潛力。對(duì)下調(diào)的hsa_circ:chr20:31876585-31897648進(jìn)行qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該分子可能是一個(gè)新的LSCC抑癌因子。

2 研究方法

2.1 根據(jù)病理分類收集LSCC樣品

    樣品通過喉頭切除術(shù)獲得，采集于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻喉科，時(shí)間是2016.08-2017.12。10個(gè)LSCC癌與癌旁配對(duì)樣品進(jìn)行二代測(cè)序，并用10對(duì)LSCC癌與癌旁配對(duì)樣品進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。本研究獲得友誼醫(yī)院倫理會(huì)的批準(zhǔn)，病人術(shù)前未進(jìn)行癌相關(guān)治療。病灶采樣后立即液氮速凍，-80℃保存。兩位病理醫(yī)生分別進(jìn)行組化評(píng)估。選出5個(gè)病人（2高分化，3中分化）用于二代測(cè)序。

2.2 RNA提取及二代測(cè)序分析

    RNA提取采用RNase/DNase-free水，在RNase-free實(shí)驗(yàn)室按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。使用Trizol法提取Total RNA，75%乙醇（1ml）清洗RNA沉淀兩次，晾干，溶于RNase/DNase-free water (20ul) 。Turbo DNase Kit (Ambion) 去除DNA殘留。RNeasy MinElute Cleanup kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 純化富集RNA。NanoDrop ND1000 spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington, DE, USA) 檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。OD260/OD280 在1.8-2.1之間，OD260/OD230 大于1.8。變性凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性及DNA殘留。為了能富集到更多的circRNAs，使用RNase R (Epicentre, Inc.) 去除線性RNA，二價(jià)陽離子適宜溫度進(jìn)行circRNAs擴(kuò)增并片段化。NEBNext® Ultra? Directional RNA Library Prep Kit 構(gòu)建RNAseq文庫(kù)，Illumina HiSeq? 3000 測(cè)序。使用HTSeq將比對(duì)到circRNA的reads數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。RPM (Reads Per Million mapped reads, including TopHat mapping and TopHat Fusion mapping) 計(jì)算circRNA的表達(dá)量。DEGseq計(jì)算circRNA的差異表達(dá)，篩選標(biāo)準(zhǔn)是q-value < 0.05, foldchange >2.0 或<0.5。

2.3 qPCR驗(yàn)證

    10例樣品RNA提取后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA (SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 。qPCR對(duì)circRNA定量 (SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 。20ul反應(yīng)體系：6.8ul cDNA， 10 ul 2 x SYBR Green mix, 0.8ul primer forward (5uM), 0.8ul primer reverse (5uM), and 1.6ul H2O。上機(jī)儀器為ABI 7300 RealTime PCR System (Applied Biosystems) ，one 2-min cycle at  50℃, one 10-min cycle at 95℃, forty cycles of 15 s at 95℃ and 1 min at 60℃。β-actin 作為內(nèi)參，pcr實(shí)驗(yàn)三次，采用2-ΔCt 法計(jì)算表達(dá)量。

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism5 (GraphPad Software, CA, USA) ，R software version 3.2.1(http://www.r-project.org/) and Microsoft Excel (Microsoft, DC, USA) ，Student’s t-test 檢測(cè)circRNA差異表達(dá)。two-sided Pvalue < 0.05 認(rèn)為有差異。

2.4 circRNA-miRNA關(guān)系預(yù)測(cè)

    circRNAs能夠通過吸附miRNAs的方式影響miRNA調(diào)控基因表達(dá)。對(duì)測(cè)序及qPCR驗(yàn)證得到的12個(gè)差異表達(dá)的circRNAs使用Arraystar miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，該軟件基于TargetScan和miRanda算法開發(fā)。Arraystar軟件尋找12個(gè)circRNAs的 MREs，并構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。Arraystar預(yù)測(cè)主要包括：1）種子序列類型，種子序列在2-7個(gè)核苷酸，2）高AU含量，3）高堿基配對(duì)，并在miRNAs 3’(13-16處堿基)配對(duì)。circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)使用cytoscape 3.01繪制。

2.5 癌相關(guān)circRNA-miRNA-靶基因預(yù)測(cè)

    使用多種數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合預(yù)測(cè)circRNA-miRNA-癌相關(guān)靶基因關(guān)系，KEGG cancer通路相關(guān)的miRNA,使用DIANA-miRPath v.3 platform預(yù)測(cè)。使用IntaRNA對(duì)circRNA及預(yù)測(cè)到的miRNAs進(jìn)行種子區(qū)再預(yù)測(cè)。DIANA-miRPath的使用參數(shù)是 suboptimal interactions 0，minimum number of basepairs in seed 5，maximum number of mismatches in seed 0，temperature for energy computation 37，folding window size target 22，max. Basepair, distance (target) 22，驗(yàn)證得到的circ-miRNA關(guān)系，使用DIANA-TarBase 7.0 鑒定候選miRNA的靶基因，并選取前10個(gè)癌相關(guān)的靶基因作為circRNA-miRNA-靶基因。

3 結(jié)果

3.1 人 SLCC樣品特征

    經(jīng)過組織學(xué)鑒定，10例新鮮組織，用于本次研究，其中3例中分化樣品，2例高分化樣品，5個(gè)配對(duì)癌旁組織。具體樣品信息如Table S1, 組化鑒定如Figure S1。

3.2 circRNA差異表達(dá)譜鑒定

使用二代測(cè)序?qū)LCC樣品進(jìn)行circRNA表達(dá)譜分析，共鑒定到21444個(gè)circRNA，其中約85% reads來源于基因組外顯子區(qū)（Fig. 1a） 。差異表達(dá)分析，即|log2(fold change)| > 1 ，Student’s t-testing Q-value < 0.05 （火山圖 Fig. 1b），相比癌旁組織，癌組織中有29個(gè)circRNAs顯著上調(diào)，19個(gè)顯著下調(diào)。（Fig. 1d and e，Table S2：差異表達(dá)總表） ，熱圖展示（Fig. 1c） 。

3.3 不同類型樣品間比較

    癌旁-高分化組，與癌旁-中分化組的差異circRNAs取交集可得到23個(gè)差異circRNAs，F(xiàn)igure 1d and e 是交集Venn圖，其中18個(gè)下調(diào)（in descending order; Fig. 1d，Table S3） ，5個(gè)上調(diào)（in descending order；Fig. 1e，Table S3）。

3.4 建立circRNA-miRNA network

    由于circRNAs可以通過miRNA response elements (MREs) 結(jié)合的方式發(fā)揮作用，使用Arraystar 軟件預(yù)測(cè)circRNA的目標(biāo)miRNA。其中3個(gè)顯著上調(diào)的circRNAs結(jié)合miRNAs信息如Table S3.其他兩個(gè)上調(diào)的circRNAs預(yù)測(cè)結(jié)果不可靠，舍棄。17個(gè)下調(diào)的circRNA預(yù)測(cè)結(jié)果也在該表中。建立circRNA-miRNA關(guān)系網(wǎng)如（Fig. 2a，注，此圖比較大，看起來比較費(fèi)勁，作者也懶得多花幾分鐘調(diào)一調(diào)這個(gè)圖，讓點(diǎn)少疊在一起）。

 3.5 GO、KEGG富集分析預(yù)測(cè)circRNA潛在功能

    有文獻(xiàn)報(bào)道circRNA能夠發(fā)揮miRNA海綿吸附作用，并調(diào)控基因表達(dá)。我們對(duì)circRNAs可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行了鑒定和排序。將circRNAs結(jié)合的前5個(gè)miRNAs用于后續(xù)分析。對(duì)miRNAs的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并做GO, KEGG富集分析。富集分析顯示circRNAs調(diào)控的基因涉及到多種生物學(xué)過程如developmental process, cellular regulation and cell junction（Figure S2）。同時(shí)也能影響許多通路如MAP kinase (MAPK) signaling pathway, Phosphatidylinositol 3-Kinase–AKT (PI3K-Akt) signaling pathway, and Ras signaling pathway （Fig. 2b ，F(xiàn)igure S3）。

3.6 預(yù)測(cè)與癌癥相關(guān)的circRNA-miRNA-target gene。

    為了更好的理解，差異表達(dá)circRNAs的分子機(jī)制，我們選擇了富集到cancer通路上的miRNA （Fig. 2b；Figure S3） 。并使用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)cancer相關(guān)的miRNA網(wǎng)絡(luò)，如圖Fig. 3a。Table S3是失調(diào)circRNAs與miRNAs結(jié)合的具體信息。最終我們挑選了前3個(gè)circRNA (hsa_circ:chr17:48268229–48,277,287, hsa_circ:chr20:31876585–31,897,648, hsa_circ:chr1:207103173–207,105,911) ，他們分別能夠結(jié)合151, 112, 208個(gè)cancer相關(guān)miRNA（Table S3）。通過對(duì)這三個(gè)circRNA結(jié)合的miRNAs取交集，發(fā)現(xiàn)miRNAs靶基因涉及到一些與癌相關(guān)的重要通路（Fig. 3a）。

3.7 前三個(gè)circRNA主要參與PPAR, AXON-guidance, Wnt 和 cell cycle 信號(hào)通路

    前三個(gè)circRNAs結(jié)合的miRNAs交集有9個(gè)（Fig. 3b） ，對(duì)這9個(gè)miRNAs的靶基因進(jìn)行了KEGG富集分析（Fig. 3c） ，主要涉及到PPAR, AXON-guidance, Wnt 和 cell cycle 信號(hào)通路。隨后，對(duì)候選的circRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，由于hsa_circ:chr17:48268229-48,277,287和hsa_circ:chr1:207103173-207,105,911沒有找到合適的引物，僅對(duì)hsa_circ:chr20:31876585-31,897,648進(jìn)行驗(yàn)證。10個(gè)病人，T為腫瘤組織，C為癌旁，qPCR結(jié)果顯示下調(diào)（Fig. 3d）。hsa_circ:chr20:31876585-31,897,648能夠顯著區(qū)分大部分的癌與癌旁組織，提示該分子或可作為L(zhǎng)SCC的一個(gè)新的分子標(biāo)志物。

    本研究，我們用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行circRNA表達(dá)譜分析，來提高對(duì)LSCC發(fā)生過程的理解。并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可具有診斷及預(yù)后判斷價(jià)值的新的circRNA標(biāo)志物。通過表達(dá)譜分析及后續(xù)的不同類型樣品取交集分析等，共發(fā)現(xiàn)20個(gè)顯著差異與癌相關(guān)的circRNA，其中16個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)。并有4個(gè)顯著上調(diào)的circRNAs是LSCC最有潛能的標(biāo)志物。另外，我們使用各種工具對(duì)20個(gè)顯著差異的circRNAs，構(gòu)建了circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。與這20個(gè)circRNAs相關(guān)的靶基因參與各種生物學(xué)過程，如growth factors binding, protein phosphatase activator activity, skin development, wound healing這些大部分與增值過程相關(guān)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因參與癌相關(guān)通路如Ras, MAPK, PI3K-AKT。之前對(duì)LSCC的分子研究主要是對(duì)基因組層面進(jìn)行分析。近些年，研究者使用芯片/測(cè)序技術(shù)研究LSCC circRNAs表達(dá)譜。circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系研究逐漸增多，但目前為止，在LSCC上還沒有報(bào)道這類關(guān)系。我們的研究深入的揭示了20個(gè)circRNAs及其可能結(jié)合的miRNAs的關(guān)系。基于這樣一個(gè)假設(shè)，越重要的circRNAs能夠結(jié)合越多癌相關(guān)的miRNAs, 進(jìn)而調(diào)控不同的癌相關(guān)的通路。因此，三個(gè)失調(diào)的circRNAs能夠共同結(jié)合9個(gè)癌相關(guān)的miRNAs。這9個(gè)miRNAs能夠調(diào)控576個(gè)mRNA。通路分析發(fā)現(xiàn)主要涉及PPAR, AXON-guidance, Wnt 和 cell cycle 信號(hào)通路。我們推測(cè)這些通路或可成為L(zhǎng)SCC潛在的治療靶點(diǎn)。本研究，也有幾點(diǎn)限制。第一，作為一個(gè)單獨(dú)研究 ，樣本量較小，統(tǒng)計(jì)學(xué)說服力不夠強(qiáng)。需要更多的研究探討LSCC中這些circRNAs的功能。第二，由于樣本量較少，circRNA與LSCC的關(guān)系及circRNA結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性也不能很好的保證。這些提示我們需要更多的研究。

4 結(jié)論

    LSCC高通量測(cè)序及生物信息分析結(jié)果，給我們提供了有用的診斷標(biāo)記，及潛在治療靶點(diǎn)，并可用于未來進(jìn)一步研究。

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