Changes in circular RNA expression patterns during human foetal brain Development

人胎兒腦發(fā)育過程中circRNAs表達譜變化

    期刊：Genomics 影響因子：2.801

    發(fā)表單位：新南威爾士大學生物技術(shù)與生物分子科學學院

1 摘要

    Circular RNAs (circRNAs)是近些年新鑒定的一類長鏈非編碼RNAs，其表達具有組織和發(fā)育階段特異性。研究表明circRNAs具有潛在調(diào)控功能，尤其是腦，腦中含有豐富的circRNAs。本研究目的是闡明人胎兒腦發(fā)育期circRNAs的表達譜變化。檢測到大量差異變化的基因包括環(huán)狀的和線性的轉(zhuǎn)錄本，許多來源于同一個基因，說明這兩種分子的調(diào)控是不同的。綜合研究顯示環(huán)狀與線性的RNA的表達譜是獨立的，circRNA轉(zhuǎn)錄本的豐度和種類在不同的發(fā)育階段有不同的特征。

2 研究方法

2.1 材料（作者并未做RNAseq實驗，而是下載的數(shù)據(jù)）

    根據(jù)來源數(shù)據(jù)的描述：人大腦皮層組織的獲取，處理，測序等按照Liu et al.描述的進行。本研究過程獲得Human Gamete, Embryo, and Stem Cell Research(GESCR) Committee (Institutional Review Board) at University of California, San Francisco (10-03379)的批準。病人捐獻的樣本也已獲得知情同意，并通過法律倫理的要求。所有的實驗方法遵從Helsinki的聲明。由中心向周邊輻射取圓柱形組織50-100mg，TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold kits (Illumina)建庫。

    我們下載4個rRNA去除的 RNAseq數(shù)據(jù)（GEO編號，GSE71315，一個是GW13, 一個是 GW14.5, 兩個是GW23；GW13, GW14.5是同一組的兩個生物學重復，代表胎兒大腦組織發(fā)育的早期，GW23代表后期）。

2.2.0 生信分析技術(shù)路線（Fig. S1）。

2.2.1 線性轉(zhuǎn)錄本分析：reads比對，轉(zhuǎn)錄本拼接，差異檢測

    4個樣品共獲得632 百萬成對reads，兩個來源于早期，兩個是后期。Tophat將reads比對到UCSC human reference genome build hg38，Tophat使用默認參數(shù)即允許兩個錯配。Cufflinks將比對好的reads拼接成轉(zhuǎn)錄本。Fragments Per Kilobase of transcripts per Million fragments mapped (FPKM)對轉(zhuǎn)錄本進行定量和標準化，gencode v26 annotation用于拼接時注釋。至少一個階段基因FPKM≥1認為基因有表達。Cuffdiff兩分組基因差異分析，并基于t-test得到的p-value計算校對值q-value。q-value<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2.2.2 環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本分析：reads比對，轉(zhuǎn)錄本拼接，差異檢測

    上述來源的FASTQ文件，先用BWA MEM (http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對到UCSC human reference genome build hg38，設置僅保留比對得分值大于19bp。使用CIRI (version 2.05)進行環(huán)狀RNA的檢測和定量，該軟件對比對的reads掃描PCC信號(paired chiastic clipping signals)，連接reads的兩部分比對到參考基因組相反的順序。gencode v26 annotation用于注釋參考，R包：edgeR基因表達差異分析。FDR<0.1認為有統(tǒng)計學意義。

2.2.3 線性、環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本pathway分析

    ClusterProfiler包用于線性和環(huán)狀RNA通路分析，用cuffdiff基因差異分析得到的1125個基因進行富集，對edgeR circRNA差異分析得到104個基因（p<0.05）進行通路富集分析。

3 結(jié)果

3.1 早期和后期胎兒大腦皮層線性轉(zhuǎn)錄本表達譜

    基于一個比較基準，我們分析了大腦皮層組織基因表達譜，首先分析每個樣品的線性轉(zhuǎn)錄本，早期(GW13 and GW14.5) and后期 (GW23)分析顯示共有16591個基因表達(Table 1)。其中1125個基因有顯著差異(q < 0.05)（Table S1）。GO富集結(jié)果包括DNA packaging（DNA包裝），regulation of mitotic nuclear division（有絲分裂調(diào)控）, and positive regulation of nervous system development（正調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育）并分為三大類(Fig. S2)，themed cell division（特定細胞分裂）, DNA replication（DNA復制）, and the nervous system（神經(jīng)系統(tǒng)）。 

3.2 早期和后期胎兒大腦皮層環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本表達譜

3.2.1 環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本鑒定

    在早期和后期胎兒大腦皮層中分別鑒定到4324 and 4425 circRNAs；6550個在兩個階段共有表達（Table 1）。39%表達的基因會產(chǎn)生circRNA轉(zhuǎn)錄本。大部分的circRNAs由基因外顯子剪接而成，占93-94%(Fig. 1)。少部分比對到基因組的內(nèi)含子和基因間區(qū)。

3.2.2 熱點基因（Hotspot genes）

    能夠產(chǎn)生10以上不同circRNAs的基因稱為熱點基因，如Table 2，鑒定到19個這類基因。3個熱點基因主要在早期表達，9個主要在后期，7個兩期都有。大部分基因表達一個circRNA，與組織區(qū)域沒有依賴性（Fig. 2）。

3.2.3 circRNAs差異表達分析

    使用配對精確檢驗，edgeR共鑒定到104個差異表達的circRNA (p < 0.05, Table S2),前三個circRNAs FDR<0.1: SATB homeobox 2(SATB2), regulating synaptic membrane exocytosis 1 (RIMS1), and CTC-525D6.1 (also known as AC011474.1) 三個circRNAs表達均升高。如（Table 3），我們發(fā)現(xiàn)倍數(shù)變化最大的circRNAs是SATB2，log2-scale值是8.21，三者的線性轉(zhuǎn)錄本的差異不明顯（Fig. 3），circRNA是該基因僅差異表達的類型。

3.2.4 差異表達circRNAs通路分析

    共104個差異表達circRNAs，ClusterProfiler鑒定到80個可用于通路分析的基因。結(jié)果顯示，差異的circRNAs主要與軸突與神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)：axon development（軸突發(fā)育）, axon guidance（軸突導向）,axonogenesi（軸突生成）, neuron projection guidance（神經(jīng)元凸起導向）, forebrain neuron differentiation（前腦神經(jīng)元分化）,positive regulation of neuron projection development（正調(diào)控神經(jīng)元凸起發(fā)育）(Table 4)。14 GO術(shù)語柱狀圖，及網(wǎng)絡圖如Fig. 4。

4 討論

    在人胎兒大腦皮層發(fā)育早期和后期共鑒定到6550個circRNAs。39%的基因既能表達線性轉(zhuǎn)錄本也能表達環(huán)狀RNA。有報道稱5.8-20%的腦表達蛋白基因能夠產(chǎn)生circRNA轉(zhuǎn)錄本。本研究發(fā)現(xiàn)了如此量大的circRNAs說明circRNA在胎兒腦發(fā)育過程中表達豐富。circRNAs: SATB2, RIMS1, and CTC-525D6.1表達顯著上調(diào)而其線性轉(zhuǎn)錄本表達沒有顯著差異。最近有研究也顯示小鼠發(fā)育期腦突觸發(fā)生時circRNAs的表達與其蛋白編碼來源基因的表達沒有依賴性。同一個基因兩種轉(zhuǎn)錄本分開表達說明二者不僅獨立合成，而且轉(zhuǎn)錄調(diào)控也不一樣。三個差異表達的circRNAs的基因或在腦中有重要的功能，或特異性表達。SATB2編碼DNA結(jié)合蛋白。發(fā)育期小鼠大腦皮層，Satb2調(diào)控軸突延伸到胼胝體，結(jié)果引起胼胝體軸突缺失。人體SATB2缺失，引起發(fā)育異常包括智障，語言遲緩，說明SATB2在神經(jīng)發(fā)育中的重要性。本研究中，差異表達的SATB2主要是以各種環(huán)狀形式的轉(zhuǎn)錄本存在。CircRNA的種類由早期的3種增加到后期16種。RIMS1是 RAS基因大家族中的一個，在調(diào)控神經(jīng)傳遞物質(zhì)釋放，突觸前長時程增強時發(fā)揮重要作用。小鼠同源基因Rim1a敲除會嚴重損傷小鼠學習記憶能力。有趣的是，一個遺傳視網(wǎng)膜失養(yǎng)癥由于RIMS1突變，顯著的提高了對許多方面認知功能，而RIMS1突變是這種認知提高的唯一可能解釋。CTC-525D6.1: 根據(jù)GTEx project (gtexportal.org; data not shown)報道53個人組織，CTC-525D6.1幾乎僅在腦組織中表達，說明其在腦組織重要性。綜合來看，研究展示了三個基因產(chǎn)生的上調(diào)表達circRNAs在腦和神經(jīng)發(fā)育中重要的作用，具體的功能和機制有待后續(xù)研究。

    差異表達的circRNA、線性轉(zhuǎn)錄本通路分析能夠富集到特定的分類。線性RNA主要富集到DNA packaging, protein complex assembly and the chromatin silencing，而circRNA主要富集到神經(jīng)發(fā)育激活相關(guān)的通路including axon guidance, neuron projection guidance, and forebrain neuron differentiation，提示circRNA的一些生物學功能。我們之前對小鼠腦區(qū)域的基因表達譜進行分析也表現(xiàn)出相同規(guī)律：差異表達的線性RNA主要與腦功能相關(guān)的功能有關(guān)如learning, memory, and cognition。而circRNA主要與神經(jīng)相關(guān)的通路有關(guān)比如dendrite morphogenesis, synapse organization and axonogenesis。而且，本研究腦形態(tài)和功能成型的妊娠期后期，富集到的GO條目涉及到與胎兒發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵事件如axon development, neuron development, and forebrain development，提示circRNA在腦發(fā)育時扮演重要角色。

    我們之前發(fā)表的人相關(guān)研究報道了>20個熱點基因，本研究鑒定到了19個熱點基因。SYNE2在早期有11環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，后期有3個環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本。SYNE2編碼外核膜蛋白能夠結(jié)合胞質(zhì)蛋白F-actin，該蛋白在人各種組織中廣泛表達，其在腦中的功能也已研究很多。SYNE2其中一個環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本在后期下降(pvlue 0.03)。SYNE2轉(zhuǎn)錄本的表達量和種類下降提示其活性下降。SATB2轉(zhuǎn)錄本由早期的3種增加到后期的16種，其中一個circRNAs是表達差異最顯著的一個，并在后期大量表達。這些發(fā)育階段特異性的熱點基因產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄本，提示不僅是轉(zhuǎn)錄本的表達量，轉(zhuǎn)錄本的多樣性在階段特異性調(diào)控中也起重要作用，可以看出circRNA功能的復雜性。

    近期研究顯示circRNA能夠調(diào)控年齡相關(guān)的疾病，比如癌，神經(jīng)組織退化疾病，說明circRNAs在臨床實踐中有重要的潛能。肝細胞癌中hsa_circ_0001569 and hsa_circ_0005075，胃癌病理相關(guān)的hsa_circ_0001895 and hsa_circ_0000190。高表達的circ_001569, hsa_circ_0000069 and CDR1as與結(jié)腸癌的病理特征相關(guān)如differentiation, distant metastasis, patients' age and tumor, node and tumor size。circRNA在Alzheimer's disease (AD)中可能也有重要的作用。miRNA-7在人腦中高豐度表達，并與ciRS-7相關(guān)。推測AD影響的腦細胞缺乏ciRS-7的海綿吸附作用，可能增加MiRNA-7的水平，進而下調(diào)MiRNA-7靶基因表達。

5 結(jié)論

    本研究描述了胎兒腦皮層兩個發(fā)育時期circRNA轉(zhuǎn)錄組的特征，鑒定到差異表達最顯著的circRNAs：SATB2, RIMS1, and CTC-525D6.1以及19個熱點基因。早期與后期circRNAs表達量與種類均有明顯的特異性，提示其在腦發(fā)育中關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)說明circRNAs是一類極具潛力的疾病分子標志物，或可成為神經(jīng)疾病藥物靶標。

6 研究思路

材料：

    下載4個rRNA 去除的 RNAseq數(shù)據(jù)（GEO編號，GSE71315，一個是GW13, 一個是 GW14.5, 兩個是GW23；GW13, GW14.5是同一組的兩個生物學重復，代表胎兒大腦組織發(fā)育的早期，GW23代表后期）

分析方法：

    線性轉(zhuǎn)錄本定量及差異表達分析：Tophat（比對）- Cufflinks（拼接）-Cuffdiff（差異分析）。

    CircRNA定量及差異表達分析：CIRI (version 2.05)鑒定和定量，edgeR差異分析。

    通路分析：ClusterProfiler進行線性轉(zhuǎn)錄本和circRNA的通路分析。

展示結(jié)果：

    1 生信分析技術(shù)路線（Fig. S1）。

    2 線性轉(zhuǎn)錄本：差異表達統(tǒng)計表（Table 1），差異表達列表（Table S1），GO富集圖柱狀圖和網(wǎng)絡圖（Fig. S2）。

    3 cicRNA：差異表達統(tǒng)計表（Table 1），基因組類型來源統(tǒng)計（Fig. 1），熱點基因數(shù)量統(tǒng)計表（Table 2），基因與產(chǎn)生circRNA數(shù)量關(guān)系柱狀圖（Fig. 2），差異circRNA列表，三個circRNAs差異統(tǒng)計表（Table 3），三個circRNA與其線性轉(zhuǎn)錄本散點圖（Fig. 3），circRNA通路富集列表（Table 4），柱狀圖（Fig. 4）。

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