Circular RNA expression profile analysis of severe acne by RNA-seq and bioinformatics

RNAseq技術(shù)和生物信息學(xué)分析重度痤瘡circRNA表達(dá)譜

期刊：JEADV  影響因子：3.528

發(fā)表單位：廣州醫(yī)科大學(xué)   

1 摘要

    背景：痤瘡是一種常見的慢性皮膚病，致病因素及發(fā)病機(jī)理多樣。近些年，人們發(fā)現(xiàn)circRNAs在多種生物學(xué)過程和人類疾病中以circRNA-miRNA-mRNA的方式調(diào)控基因表達(dá)。但在痤瘡病人中circRNAs的表達(dá)譜并未報(bào)道過。

    目的：研究重度痤瘡circRNA 表達(dá)譜。

    方法：通過高通量RNAseq技術(shù)和生物信息學(xué)方法研究三對(duì)重度痤瘡病損皮膚及周圍非病損皮膚組織。RT-PCR，Sanger測序，qPCR（別的樣品n=4）,驗(yàn)證后續(xù)circRNAs。預(yù)測circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

    結(jié)果：重度痤瘡相比周邊正常組織，病損組織中有538個(gè)circRNAs差異表達(dá)，其中271個(gè)上調(diào)，267個(gè)下調(diào)。GO，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的circRNAs主要涉及到inflammatory（炎癥）,  metabolism（代謝）, and immune responses（免疫應(yīng)答）。RT-PCR，Sanger測序，qPCR驗(yàn)證5個(gè)候選circRNAs(circRNA_0084927, circRNA_0001073, circRNA_0005941, circRNA_0086376, and circRNA_0018168)，均顯著下調(diào)，結(jié)果與RNAseq結(jié)果一致。此5個(gè)circRNAs可以與213個(gè)miRNAs結(jié)合，并調(diào)控靶基因表達(dá)。

    結(jié)論：本研究第一次揭示circRNAs在重度痤瘡差異表達(dá)，circRNAs可以作為藥物治療痤瘡的潛在標(biāo)志物。

2 材料方法

1 材料

    共收集7個(gè)病人（RNAseq分析：3男性，平均年齡22.3；PCR，Sanger測序，qPCR：4男性，平均年齡：21），至少兩個(gè)皮膚病學(xué)家依據(jù)Pillsbury分級(jí)系統(tǒng)準(zhǔn)確判斷為重度痤瘡(grade IV)。取病人配對(duì)的病損組織及旁邊非病損組織（病損區(qū)2cm），本研究獲得廣州皮膚病研究所皮膚科醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵從Helsinki Guidelines聲明進(jìn)行。

2 Illumina 測序

    Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取total RNA。RNaseR酶消化線性RNA，RNAClean beads純化，剩余RNA二價(jià)陽離子適宜溫度片段化。隨機(jī)六聚體引物合成第一鏈cDNA。AMPure 磁珠純化片段，溶于EB buffer，用于末端修復(fù)并在3’端添加A，而后添加接頭構(gòu)建cDNA文庫。最后，文庫質(zhì)檢合格后，Illumina HiSeq 4000 platform 測序，模式為雙端100bp。

3 circRNAs鑒定

    下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)控后，將clean reads先比對(duì)到參考基因組（GRCh37/hg19），參數(shù)為bwa mem -T 19。CIRI預(yù)測circRNAs，gencodeV19. annotation.gtf 用于注釋文件。為了與circBase數(shù)據(jù)庫比較，circRNAs使用TPM校正，并使用Pearson比較每個(gè)樣本的相關(guān)性。為了研究circRNAs保守性，使用phyloP軟件計(jì)算circRNAs序列的保守得分，平均得分。

4 circRNA差異表達(dá)分析

    分別用NOISeq and PossionDis進(jìn)行差異表達(dá)分析。過濾掉表達(dá)量極低的circRNAs，NOISeq probability > 0.8并且PossionDis FDR< 0.001認(rèn)為是有顯著表達(dá)差異的circRNAs。對(duì)候選基因進(jìn)行GO，KEGG富集分析，并基于STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

5 circRNA驗(yàn)證

    特殊的circRNAs引物擴(kuò)增total RNA和基因組DNA。PCR產(chǎn)物2% (w/v)瓊脂糖凝膠分離，Sanger測序。引物如TableS1。GoTaq® qPCR Master Mix (A6002, Promega, USA) qPCR分析。熔解曲線分析引物特異性，2?△△Ct計(jì)算circRNAs相對(duì)差異表達(dá)。

6 預(yù)測circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系

    使用TargetScan和miRanda兩種算法（基于miRBase 21.0）預(yù)測circRNAs結(jié)合的miRNAs。基于miRTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-mRNA關(guān)系。Cytoscape構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

7 統(tǒng)計(jì)分析

    Wilcoxon rank-sum test, Student’s t-test and fold change 計(jì)算測序數(shù)據(jù)circRNAs的差異。qPCR結(jié)果計(jì)算Pearson’s相關(guān)性。P < 0.05認(rèn)為有意義。差異表達(dá)circRNAs和mRNA的差異表達(dá)倍數(shù)設(shè)置為≥2.0。

3 結(jié)果

1 circRNA表達(dá)譜

    病損皮膚中共鑒定到35782個(gè)circRNAs，非病損皮膚中共鑒定到27700個(gè)。兩者circRNAs的類型（全部circRNAs，外顯子circRNAs，內(nèi)含子circRNAs，基因間circRNAs）的分布基本相似(Fig. 1A)。大部分的circRNAs（病損皮膚87%，非病損皮膚84%）來源于蛋白編碼基因外顯子，剩余其它則來源于內(nèi)含子或基因間區(qū)域。兩組間circRNAs的表達(dá)差異用三點(diǎn)圖評(píng)估(Fig.1B)，circRNAs差異表達(dá)火山圖(Fig.1C)。差異表達(dá)circRNAs熱圖(Fig. 2A)，不同分組間circRNAs表達(dá)的相關(guān)性(Fig. 2B).。共鑒定到538個(gè)差異的circRNAs，271個(gè)上調(diào)，267個(gè)下調(diào)。其中330個(gè)是新的circRNAs（不存在與circBase數(shù)據(jù)庫），比如(cLCE2B, cAHNAK, and cANKRD36BP2)。分析差異表達(dá)circRNAs富集到的top10 GO (cellular component, molecular function and biological process)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)主要涉及到leukocyte transendothelial migration（白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移）, small cell lung cancer（非小細(xì)胞肺癌）, protein digestion and absorption（蛋白消化和吸收）, arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy（致心律失常性右室心肌?。? and focal adhesion（粘著斑）(Fig. 3D)。

2 差異表達(dá) circRNAs驗(yàn)證

    挑選15個(gè)顯著差異的circRNAs用于驗(yàn)證，其中5個(gè)是新的(Table 1)。為了驗(yàn)證選擇的是否確定是circRNAs，使用發(fā)散性divergent引物，和收斂convergent引物，分別進(jìn)行RT-PCR。其中11個(gè)毫無疑問可以用發(fā)散性引物從cDNA中擴(kuò)增出(Fig. 4A)，剩下的4個(gè)不能，說明這些circRNAs的表達(dá)量很低或者沒有表達(dá)。對(duì)于挑選得到的11個(gè)circRNAs使用Sanger測序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，鑒定heat-to-tail連接點(diǎn)(Fig. 4B)。這11個(gè)circRNAs進(jìn)一步用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示5個(gè)顯著下調(diào)(Fig.5)與測序結(jié)果一致，而其他6個(gè)與測序結(jié)果不一致或沒有顯著差異變化(Suppl. Fig. 1)。

3 預(yù)測circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

    5個(gè)鑒定到的circRNAs可以預(yù)測到213個(gè)miRNAs。取前5個(gè)預(yù)測的miRNAs及其靶基因基因使用Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖展示(Fig. 6 and Suppl. Table 2)。其中部分circRNAs預(yù)測的miRNAs是重疊的，如miR-145-5p可以被3個(gè)circRNAs結(jié)合(circRNA_0005941, circRNA_0086376 and circRNA_0018168)，是網(wǎng)絡(luò)中最大的關(guān)系節(jié)點(diǎn)。

4 討論

    circRNAs是一種連續(xù)的共價(jià)閉環(huán)的分子，病毒，植物，動(dòng)物中均有檢測到。越來越多的研究者開始關(guān)注circRNAs的潛在功能，比如miRNAs海綿吸附調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)而影響生理過程或疾病。最近有些miRNAs如as miR-143，miR-338-3p在調(diào)控痤瘡的炎癥反應(yīng)中有重要作用。據(jù)我們所知，本研究第一次深入研究重度痤瘡circRNAs表達(dá)譜及其潛在功能。使用高通量測序及生信分析，共鑒定到538個(gè)差異表達(dá)的circRNAs，其中271個(gè)上調(diào)circRNAs，267個(gè)下調(diào)。GO，KEGG富集分析顯示差異表達(dá)的circRNAs主要與inflammatory, metabolism, and immune responses相關(guān)，這些在痤瘡病理生理學(xué)中很重要。挑選11個(gè)circRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，5 circRNAs (circRNA_0084927, circRNA_0001073, circRNA_0005941, circRNA_0086376, circRNA_0018168)用于后續(xù)PCR, Sanger sequencing, and qRT-PCR驗(yàn)證，這些與測序結(jié)果一致，可能參與重度痤瘡的起始與進(jìn)展。然而，未來需要更大樣本量及基于circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的發(fā)病機(jī)制研究。這些結(jié)果給我們研究重度痤瘡機(jī)制提供了一個(gè)新的角度。

5 研究思路

材料：

    7個(gè)病人（RNAseq分析：3男性；PCR，Sanger測序，qPCR：4男性）

研究方法：

    1 建庫采用去線性RNA，去核糖體RNA建庫方式，HiSeq 4000，PE100測序。

    2 CIRI預(yù)測circRNAs，gencodeV19. annotation.gtf 用于注釋文件。circRNAs使用TPM校正，并使用Pearson比較樣本相關(guān)性。phyloP軟件計(jì)算circRNAs序列的保守得分，平均得分。

    3 NOISeq and PossionDis進(jìn)行差異表達(dá)分析。過濾掉表達(dá)量極低的circRNAs，NOISeq probability > 0.8 并且 PossionDis FDR< 0.001認(rèn)為是有顯著表達(dá)差異的circRNAs。對(duì)候選基因進(jìn)行GO，KEGG富集分析，基于STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

    4 PCR, Sanger sequencing, and qRT-PCR circRNAs驗(yàn)證。

    5 TargetScan，miRanda，miRTarBase預(yù)測circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系，Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié)果展示：

    1 circRNAs表達(dá)譜： 保守性得分箱型圖(Fig. 1A)，兩分組整體表達(dá)散點(diǎn)圖(Fig.1B)，差異表達(dá)火山圖(Fig.1C)，差異表達(dá)circRNAs熱圖(Fig. 2A)，樣品相關(guān)性圖(Fig. 2B)，GO，KEGG富集結(jié)果柱狀圖(Fig. 3)。

    2 circRNAs驗(yàn)證：挑選15個(gè)circRNAs(Table 1)，RT-PCR擴(kuò)增電泳圖(Fig. 4A)，Sanger測序(Fig. 4B)，qPCR驗(yàn)證(Fig.5，Suppl. Fig. 1)。

    3 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)(Fig. 6 and Suppl. Table 2)。

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