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A novel plasma circular RNA circFARSA is a potential biomarker for non-small cell lung cancer
A novel plasma circular RNA circFARSA is a potential biomarker for non-small cell lung cancer
血漿circFARSA或可作為非小細胞肺癌分子標志物
期刊：Cancer Medicine 影響因子：3.362
發(fā)表單位：南京醫(yī)科大學
1 摘要
越來越多的證據(jù)表明circRNAs與癌癥的發(fā)展密切相關。本研究的目的是評估circRNAs是否可以作為non-small cell lung cancer (NSCLC)新的分子標志物。我們使用RNAseq技術與qPCR的方法研究cancer相關的circRNAs。對肺癌circRNAs進行生物信息學和功能分析以揭示其生物學影響。RNAseq共鑒定到5471個circRNAs，其中185個在癌與癌旁組織中有差異表達。來自FARSA基因5-7外顯子的環(huán)狀RNA，命名為circFARSA，在癌組織中上調(P = 0.016),并在病人的血漿高豐度表達(P < 0.001)。A549細胞系過表達circFARSA，可以顯著促銷細胞遷移和侵襲。生信分析顯示circFARSA或可海綿吸附miR-330-5p 和 miR-326，進而緩解對癌基因脂肪酸合酶的抑制作用。簡單來說，本研究第一次揭示了NSCLC circRNA表達譜，并證明血漿circFARSA或可作為惡性腫瘤非侵入性的分子標志物。
2 材料方法
1 研究種群和樣品收集
本研究獲得南京醫(yī)科大學倫理委員會的批準，并遵從Helsinki聲明。實驗分為兩個階段(Fig. S1)。高通量篩選，南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收集10對非小細胞肺癌癌組織和癌旁組織，時間是2014.10-2015.12 (Table S1)。組織標本保存在RNAlater中，HE切片染色確認是代表性樣品。驗證時，招募50個非小細胞肺癌病人，并收集其血漿。排除有過其他癌，轉移癌，或者接受過化療放療的。收集同期50個健康體檢者的血漿。對照組沒有癌，并依據(jù)年齡，性別與病人組(±5 years)進行配對。獲得同意后，獲取參與者相關信息如年齡，性別，抽煙情況等。
2 RNAseq及circRNA鑒定
RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)提取組織total RNA，Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA)評估質量。RNA Integrity Number ≥7.5可用于后續(xù)文庫構建實驗。去除rRNA, 而后使用TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA)按照RNA片段化，隨機引物cDNA合成，連接接頭，PCR擴增流程進行。純化后的cDNA文庫Illumina HiSeq1500 platform上機測序，模式PE150.
CASAVA v1.8.2將BCL files轉換為FASTQ格式，Trimmomatic version 0.32.43去除接頭和低質量reads，使用參數(shù)為(ILLUMINACLIP: adapter.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:20)。CIRCexplorer v 1.1.10流程用于鑒定和定量circRNAs，參數(shù)默認。至少含有兩個back-spliced reads支持時方可確定為有效的circRNAs。剪接位點之間所有的reads作為表達量的豐度，用于計算circRNAs表達量。
3 血漿RNA提取和cDNA合成
TRIzol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) and RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)提取total RNA。為了設置內參，將100ng人工合成線蟲totalRNA加入到血漿樣品（200ul）中, 然后進行RNA提取。NanoDrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE)檢測RNA的純度和密度。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。random primers (PrimeScript RT Master Mix, Takara, Japan)合成模板cDNA。
4 qPCR分析
SYBR Premix Ex Taq? II (Taraka, Japan) on ABI 7900 system進行qPCR，Cel-circRNA9 (cel_9)在線蟲中高豐度表達，用于內參。cel_9 的發(fā)散引物為5′-TTGCAGCTCTCATAGAAGGAACCG-3′(sense) and 5′-GTTTCAGCCGAGACTAGACTTTGAGC-3′(antisense)；而circFARSA的發(fā)散引物為5-GCTCCTTCTGGAACTTTGAC-3′(sense) and 5′-TTGCTCACCCAGTAGGTCTT-3′(antisense)。PCR產(chǎn)物進一步用Sanger測序檢測成環(huán)位點。2?ΔΔCt計算circRNAs相對表達量。三個獨立實驗重復三次保證實驗的可靠性。
5 質粒構建
SH-SY5Y細胞編碼circFARSA的cDNA用以下引物進行擴增5′-CGGAATTCTGAAATATGCTATCTTACAGGACTCTGAAGACCTACTGGGTGAG-3′and 5′-CGGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCTCGAAGGAAGAAGGTGTCGTGCT-3′。目標區(qū)域長度394bp，序列包含EcoR Isite，splice acceptor AG, circFARSA sequence, splice donor GT, and Bam HI site。EcoR I and Bam HI酶消化后，將片段克隆至pLCDH-ciR vector，對轉錄本進行環(huán)化。Sanger sequencing and qRT-PCR驗證構建的質粒。
6 細胞增殖，遷移和侵襲實驗
人類肺癌細胞系，A549購買于ATCC (American Type Culture Collection)，通過short tandem repeat (STR)確認。CCK-8 kit (Doindo, Japan)試劑盒進行增殖實驗。在0, 12, 24, 36, 48, and 72 h,加入CCK-8試劑，37℃孵育2h。microplate reader (BioTek, Winooski, VT)測量450nm處峰值。使用Costar Transwell plates (Coring, NY)按照之前描述的方法進行細胞遷移和侵襲實驗。所有實驗均獨立重復三次。
7 生信分析
將circRNA序列作為種子，使用Circular RNA Interactome（基于TargetScan算法）預測circRNA-miRNA關系。而且，DIANA-TarBas ev.7.0構建miRNA-mRNA關系并進行KEGG分析，數(shù)據(jù)庫來源于幾百個文獻實驗驗證的數(shù)據(jù)，包括超過150個CLIP-Sep庫。Cytoscape software (http://www.cytoscape.org/)構建circRNA–miRNA–mRNA關系。
于TCGA data portal (https://portal.gdc.cancer.gov/)下載488 LUAD病人（包含57對癌與癌旁配對樣品），489 LUSC病人（包含50個癌與癌旁配對樣品）RNAseq數(shù)據(jù)（level 3）。網(wǎng)頁版Kaplan–Meier plotter，包含許多芯片數(shù)據(jù)，分析FASN預后值。Jetset scoring鑒定最優(yōu)芯片探針。
8 統(tǒng)計分析
GraphPad Prism 6(GraphPad Software, San Diego, CA) and R software version3.3.0 (Free Software Foundation’s GNU project)進行統(tǒng)計分析。DESeq2鑒定RNAseq差異表達的circRNAs。TreeView 軟件對差異表達顯著的 circRNA進行聚類分析。計算Pearson相關性評估了組織與血漿circRNAs關系。血漿中差異表達circRNAs使用log轉換，并用paired t-tests評估，P < 0.05認為有統(tǒng)計學意義，另所有檢驗都是雙尾的。
3 結果
1鑒定差異表達circRNA表達譜
RNAseq在10個樣品中共鑒定到5371個circRNAs。火山圖展示癌與癌旁樣品差異表達的circRNAs (Fig. 1A)。185 circRNAs有差異表達(P < 0.05)，120個上調，65個下調 。tableS2是上下調top10 circRNAs。circRNAs在染色體的分布圖如Figure 1B。聚類熱圖展示差異表達的circRNAs表達譜(Fig. 1C)。數(shù)據(jù)顯示非小細胞肺癌癌與癌旁中circRNAs的表達譜是不同的。
2 10個NSCLC病人血漿檢測候選circRNAs
為了在血漿中更好的找到合適的circRNAs，我們結合已經(jīng)發(fā)表的血清circRNAs表達譜數(shù)據(jù)，及我們發(fā)現(xiàn)上調的circRNAs數(shù)據(jù)。table S3列出前10個可以在血清中鑒定到的和上調的circRNAs。我們對這10個circRNAs在10個病人血漿中做了qPCR檢測。其中circCCDC134沒有找到合適的引物，其他9個均有檢測到。circFARSA豐度最高。circFARSA在血漿與組織中表達量是相關的(r = 0.64, P = 0.047) (Fig. 2B)。
這是第一次對circFARSA設計發(fā)散引物，線蟲cel_9作為內參，沒有引物二聚體或特異性性擴增amplification (Fig. S2)。通過擴增circFARSA產(chǎn)物測序，我們確信序列與circBase的序列是一致的(http://www.circbase.org) (Fig. S3)。
3 NSCLC病人血漿circFARSA上調表達
qPCR驗證circFARSA在50個NSCLC病人血漿和正常人血漿中的表達量。結果顯示circFARSA在病人血漿中的表達量更高(P < 0.001)。我們也檢測了血漿FARSA的mRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)表達豐度太低而沒有檢測到。
我們進一步分析血漿circFARSA表達量與病人臨床特征的關系(Table S4)。除了與性別(P = 0.048)外，其他特征均沒有顯著的統(tǒng)計關系。
繪制ROC曲線(Fig. 2D)以評估circFARSA在NSCLC病人與健康人之間的診斷價值。ROC曲線以下區(qū)域面積為0.71。
4 circFARSA表型功能
轉染A549細胞，進行circFARSA過表達并用qPCR驗證(Fig. S4A)。相比于空載體，circFARSA質粒細胞增殖的能力沒有增強(Fig. S5)，而遷移和侵襲能力增強(Fig. 3)。為了排除FARSA mRNA對于細胞遷移和侵襲的干擾。我們檢測了circFARSA質粒加入前加入后FARSA mRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)并沒有顯著變化(Fig. S4B)。
5 circFARSA調控的miRNA–mRNA通路
使用Circular RNA Interactome工具，我們得到了circFARSA結合的前5個miRNA：miR-330-5p, miR-326, miR-1178-3p, miR-620, and miR-1270，依據(jù)KEGG分析，得到12個通路，fatty acid biosynthesis通路是最顯著的一個(Fig. 4A)。Cytoscape構建circRNA–microRNA–mRNA關系，發(fā)現(xiàn)miR-330-5p and miR-326有著最大的關系網(wǎng)(Fig. 4B)。
依據(jù)TarBase中HITS-CLIP實驗，miR-330-5p and miR-326均能直接與fatty acid synthase (FASN)結合，該基因是各種癌中是一個癌基因。TCGA數(shù)據(jù)庫，F(xiàn)ASN在肺腺癌(n = 57, P < 0.001)和鱗狀癌(n = 50, P = 0.005)中均高表達(Fig. S6A)。芯片數(shù)據(jù)Kaplan–Meier plotter (n = 1926)分析了FASN與預后的關系(HR = 1.81, 95% CI: 1.47–2.21, adjusted for clinical stage) (Fig. S6B)。
4 討論
本研究，我們對NSCLC病人樣品使用RNAseq技術發(fā)現(xiàn)了120個上調的circRNA，和65個下調的circRNAs。為了更好的在血漿中得到候選的circRNAs，我們整合已經(jīng)發(fā)表的血清circRNAs表達譜數(shù)據(jù)及我們的數(shù)據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)在血清可檢測到的9個circRNAs中，circFARSA的表達豐度是最高的，而且，相比對照，NSCLC病人血漿circFARSA的表達量更高。ROC曲線下方值是0.71，顯示血漿circFARSA或可作為NSCLC分子標志物。
近期研究表明有些 circRNAs在唾液，血清/血漿，血液中的表達是豐富而且穩(wěn)定的。一個有趣的可能性是circRNAs通過一些載體比如外泌體分泌到胞外區(qū)間，這是病灶組織主動或被動的一種釋放。Li et al.發(fā)現(xiàn)外泌體circRNAs能夠區(qū)分結腸直腸癌病人和健康人。本研究，我們發(fā)現(xiàn)NSCLC病人組織樣品與血漿樣品circFARSA表達量有相關性。相比于外泌體提取的circRNAs中circFARSA表達量，我們發(fā)現(xiàn)血漿中的表達量更高。我們推斷可能是其他的方式將circFARSA釋放到血液中。
有報道稱circRNAs具有海綿吸附miRNA作用，并可以調控miRNA靶基因的表達。比如CDR1as可以結合miR-7并下調一系列癌基因比如EGFR的表達。circHIPK3可以結合多個miRNAs，包括著名的腫瘤抑制因子miR-124。本研究，我們發(fā)現(xiàn)過表達circFARSA可以促進細胞遷移和侵襲。生信分析發(fā)現(xiàn)circFARSA具有許多miRNAs保守結合位點，比如miR-330-5p, miR-326, miR-1178-3p, miR-620, and miR-1270。這些miRNAs存在于一些癌相關的通路，包括脂肪酸合成，這在細胞的增殖和代謝中是極為重要的。之前研究表明miR-330-5p可以抑制胰腺癌細胞MUC1表達，并且下調結腸直腸癌ITGA5表達。而且miR-326可以通過下調癌基因CCND1抑制NSCLC的惡性表型變化。根據(jù)TarBase數(shù)據(jù)庫，miR-330-5p and miR-326或可直接結合FASN基因，該基因是各種癌中一個代謝相關基因。而且，通過分析TCGA數(shù)據(jù)和在線芯片數(shù)據(jù)，我們確信肺癌高FASN與差的預后相關。因此，我們的發(fā)現(xiàn)支持一個假設，即circFARSA可以通過海綿吸附miR-330-5p/miR-326，減少對癌基因FASN抑制，進而促進肺癌發(fā)展。
本研究有幾點意義。第一，使用RNAseq技術揭示了NSCLC circRNAs的整體差異表達情況。第二，第一次嘗試研究NSCLC病人，血漿circRNAs作為分子標志物。我們發(fā)現(xiàn)線蟲circRNA，cel_9在人血漿中可以穩(wěn)定存在，并適合作為內參。最后，生信分析及體外實驗均顯示circFARSA在肺癌進展中極為重要。然而，本研究也有幾點限制。首先，雖然采用兩步實驗，對 circRNAs進行篩選和驗證，但樣本量還是較少。其他circRNAs仍可能作為肺癌的分子標志物，后續(xù)研究需要更大樣本量的circRNAs篩選和血漿驗證。第二，需要做更多的功能實驗以研究NSCLC病人中circFARSA–miRNA–FASN關系。
總結，本研究通過一系列證據(jù)證明血漿circFARSA可以作為NSCLC新的分子標志物。我們的研究也給以后研究循環(huán)circRNAs作為癌非侵入性分子標志物提供了一個參考。
5 研究思路
實驗材料：
10對NSCLC病人癌與癌旁組織，50例NSCLC病人血漿，50例健康人血漿，TCGA數(shù)據(jù)庫，已發(fā)表血清circRNAs表達譜數(shù)據(jù)。
研究過程：
1 10對癌與癌旁樣品，RNAseq，去rRNA建庫，未去除線性RNA。CIRCexplorer鑒定并定量circRNAs，DESeq2進行差異分析，fc >2 and P < 0.05認為有差異（為什么不是q< 0.05?）。
2 整合本數(shù)據(jù)與已發(fā)表的血清circRNAs表達譜挑選10個circRNAs，并在10個病人中進行初步驗證。
3 對circFARSA擴大到50對樣品中進行驗證。
4 過表達circFARSA，觀察肺癌細胞增殖，遷移，侵襲情況。
5 Circular RNA Interactome，DIANA-TarBas ev.7.0，TarBase 構建circFARSA-miRNA-mRNA調控網(wǎng)絡。
結果展示：
1 circRNA表達譜描述
火山圖（Fig. 1A），circRNAs在染色體上分布柱狀圖（Fig. 1B），差異表達circRNAs熱圖（Fig. 1C）。
2 qPCR驗證
10例病人9個circRNAs qPCR驗證柱狀圖（Fig. 2A），circFARSA和cel_9是否特異性擴增熔解曲線（Fig. S2），Sanger測序驗證circFARSA成環(huán)（Fig. S3）。
3 血漿circFARSA驗證
circFARSA 50對血漿中檢測（Fig. 2C），血漿circFARSA表達量與病人臨床特征的關系(Table S4），ROC曲線(Fig. 2D）。
4 circFARSA表型功能
細胞增殖曲線圖(Fig. S5），遷移和侵襲(Fig. 3），
5 circFARSA調控的miRNA–mRNA通路
KEGG通路柱狀圖(Fig. 4A），circRNA–microRNA–mRNA網(wǎng)絡圖(Fig. 4B）。FASN在肺腺癌中表達量(Fig. S6A），F(xiàn)ASN與預后的關系Kaplan–Meier曲線(Fig. S6B）。
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