Long Noncoding RNA uc.173 Promotes Renewal of the Intestinal Mucosa by Inducing Degradation of MicroRNA195

長(zhǎng)非編碼RNA uc.173通過(guò)誘導(dǎo)MicroRNA-195的降解促進(jìn)腸粘膜的更新

    期刊：Gastroenterology；影響因子：20.773        

    發(fā)表單位：馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院

哺乳動(dòng)物腸粘膜上皮在整個(gè)生命體內(nèi)經(jīng)歷快速和持續(xù)的更新，并作為管腔微生物群和身體之間的物理屏障。人類(lèi)小腸上皮細(xì)胞每天經(jīng)歷大約10¹¹個(gè)有絲分裂，這種快速周轉(zhuǎn)率受到多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外因子的嚴(yán)密控制，以維持組織穩(wěn)態(tài)。長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）被定義為跨越> 200nt長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)錄RNA，其控制基因表達(dá)的每個(gè)水平，包括染色質(zhì)重塑，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過(guò)程以及蛋白質(zhì)代謝。lncRNAs可以是前體miRNA（pri-miRNA），作為miRNA的分子海綿，和/或控制pri-miRNA加工。超保守區(qū)域（UCR）代表人類(lèi)基因組的保守序列，它們可能具有功能，但是不編碼蛋白質(zhì)，因此被稱(chēng)為人類(lèi)基因組的“暗物質(zhì)”。從UCR（T-UCRs）轉(zhuǎn)錄的RNA是一類(lèi)有趣的lncRNA，因?yàn)樗鹪从诨騼?nèi)或基因間區(qū)域的基因組元件，在許多哺乳動(dòng)物基因組中具有接近完美的進(jìn)化保守性。

為了確定T-UCR在腸粘膜生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的作用，將食物饑餓誘導(dǎo)的粘膜萎縮用作模型，并進(jìn)行基于微陣列的全局T-UCR表達(dá)譜的篩選。禁食48小時(shí)抑制了小鼠的小腸粘膜生長(zhǎng)。表達(dá)譜的比較顯示21個(gè)T-UCR差異表達(dá)，禁食48小時(shí)的小鼠中18種T-UCR包括uc.481，uc.356，uc.173等表達(dá)減少，而3種T-UCR包括uc.457，uc.477和uc.457表達(dá)增加（圖1A，B）。

我們專(zhuān)注于uc.173，因?yàn)橐种普衬どL(zhǎng)后其表達(dá)量變化強(qiáng)烈，基于miRNA預(yù)測(cè)，uc.173與包括miRNA195在內(nèi)的幾種miRNA存在潛在的相互作用。此外，uc.173表達(dá)基礎(chǔ)水平比其他T-UCR的基礎(chǔ)水平高。而后qPCR驗(yàn)證，證實(shí)48小時(shí)的禁食顯著降低了小腸粘膜中的uc.173水平。對(duì)Caco-2細(xì)胞的分析進(jìn)一步表明，通過(guò)用DFMO（D，L-α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸）耗盡細(xì)胞多胺來(lái)抑制細(xì)胞增殖也與細(xì)胞水平的降低有關(guān)。DFMO處理4天幾乎完全耗盡細(xì)胞多胺并導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞經(jīng)歷G1期生長(zhǎng)停滯。與DFMO一起給予的外源性聚胺腐胺拯救了uc.173表達(dá)并恢復(fù)了細(xì)胞增殖。

為了確定uc.173在控制腸上皮細(xì)胞更新中的功能。我們過(guò)表達(dá)uc.173水平檢測(cè)對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)和從小鼠中小腸分離的培養(yǎng)的orga-noids的影響。在Caco-2細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)uc.173水平，與對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，uc.173的高表達(dá)增加了細(xì)胞數(shù)量。離體模型中，過(guò)表達(dá)uc.173刺激了腸類(lèi)器官的生長(zhǎng)。引人注目的是，通過(guò)增加的BrdU摻入確定，uc.173的高表達(dá)顯著激活了多個(gè)細(xì)胞中的DNA合成，并增強(qiáng)了腸類(lèi)器官的表面積。在uc.173過(guò)表達(dá)后，每個(gè)類(lèi)器官的細(xì)胞數(shù)量也增加。這些結(jié)果表明，增加uc.173的水平促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。

其次，使用LNA修飾的寡聚體沉默uc.173是否會(huì)抑制腸粘膜的生長(zhǎng)。Caco-2細(xì)胞敲低uc.173水平抑制了IEC的增殖，為了排除脫靶效應(yīng)，測(cè)試了2種抗uc.173寡核苷酸，抗uc.173_1和抗uc.173_2，顯示出相似的結(jié)果。我們還檢測(cè)了uc.173沉默對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響。與在Caco-2細(xì)胞中觀察到的相似，通過(guò)轉(zhuǎn)染抗-uc.173_1降低uc.173水平也抑制了IEC-6細(xì)胞的增殖。

此外，uc.173沉默增加了p53的豐度但降低了CDK4蛋白的水平。在暴露于uc.173拮抗作用的小鼠中，粘膜中細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA21的水平也降低。有趣的是，從克羅恩病患者獲得的腸粘膜組織顯示出與對(duì)照組（無(wú)粘膜損傷或炎癥組）中觀察到的uc.173水平顯著降低。粘膜uc.173的水平降低與細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67的降低相關(guān)。總之，研究結(jié)果強(qiáng)烈支持uc.173是腸上皮體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其誘導(dǎo)增強(qiáng)小腸粘膜的生長(zhǎng)。

為了測(cè)試uc.173是否通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA功能刺激腸粘膜生長(zhǎng)，我們檢測(cè)了改變uc.173水平對(duì)Caco-2細(xì)胞中幾種miRNA（包括miRNA29b，miRNA195，miRNA222和miRNA503）水平的影響。我們專(zhuān)注于這組選擇的miRNA，因?yàn)樗鼈兊幕A(chǔ)水平在腸粘膜中相對(duì)較高，并且發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平的變化改變腸粘膜再生。敲低uc.173增強(qiáng)了miRNA195的表達(dá)，與對(duì)照相比，成熟miRNA195的水平在uc.173敲低細(xì)胞中增加。另一方面，過(guò)表達(dá)uc.173降低了miRNA195表達(dá)水平。有趣的是，uc.173敲低也增加了miRNA195的前體轉(zhuǎn)錄本pri-miR-195的水平，而過(guò)表達(dá)uc.173的水平降低了pri-miR-195的豐度。降低小腸粘膜中的uc.173水平也增加了小鼠中的miRNA195水平。

為了確定uc.173是否在轉(zhuǎn)錄水平抑制miRNA195表達(dá)，我們檢測(cè)了uc.173沉默后轉(zhuǎn)錄因子JunD和p53水平的變化。JunD和p53刺激編碼pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本的幾種基因的轉(zhuǎn)錄，并且在miR-195啟動(dòng)子中鑒定出JunD（AP-1）和p53的潛在結(jié)合位點(diǎn)。敲低uc.173增加了JunD和p53的水平。接下來(lái)，我們從人基因組DNA克隆miRNA195啟動(dòng)子，然后將其亞克隆到熒光素酶報(bào)道載體中。出乎意料的是，敲低uc.173不改變Caco-2和IEC-6細(xì)胞的miRNA195啟動(dòng)子活性。一致地，對(duì)照和過(guò)表達(dá)uc.173的細(xì)胞之間miRNA195啟動(dòng)子活性水平?jīng)]有顯著差異。結(jié)果表明uc.173通過(guò)其他的機(jī)制而不是其基因轉(zhuǎn)錄抑制miRNA195的表達(dá)。

    Pri-miR-195顯示與位于pri-miR-195的中心莖區(qū)的7個(gè)核苷酸處的uc.173完全互補(bǔ)（圖6A）。為了測(cè)試這兩種ncRNA之間是否存在直接相互作用，使用生物素化的pri-miR-195進(jìn)行RNA下拉測(cè)定。使用biot-pri-miR-195下拉的樣品中的uc.173水平遠(yuǎn)高于對(duì)照。uc.173與pri-miR-195的這種直接關(guān)聯(lián)是特異性的，因?yàn)樯锼貥?biāo)記的pri-miRNA195未能降低uc.346或uc.283。成熟的miRNA195與uc.173不是互補(bǔ)的，也沒(méi)有下調(diào)uc.173。我們進(jìn)一步檢查了uc.173過(guò)表達(dá)后pri-miR-195穩(wěn)定性的變化，發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的uc.173增強(qiáng)了pri-miR-195的降解。與用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，過(guò)量表達(dá)uc.173的細(xì)胞中pri-miR-195的半衰期顯著降低。結(jié)果表明uc.173主要通過(guò)使pri-miR-195轉(zhuǎn)錄本去穩(wěn)定來(lái)抑制miRNA195表達(dá)。

我們的結(jié)果進(jìn)一步揭示了uc.173介導(dǎo)的miRNA195抑制對(duì)于控制IEC增殖至關(guān)重要。通過(guò)uc.173沉默增加內(nèi)源miRNA195的水平抑制細(xì)胞增殖，并且這種效應(yīng)幾乎完全通過(guò)miRNA195 antagomir的異常轉(zhuǎn)染來(lái)挽救。相反，過(guò)表達(dá)uc.173對(duì)細(xì)胞增殖的刺激通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA195前體（pre-miR-195）增加細(xì)胞miRNA195的水平而被抑制。事實(shí)上，與pre-miR-195和uc.173表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞數(shù)低于用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的細(xì)胞數(shù)。總之，我們的發(fā)現(xiàn)提出了一種新模型，其中uc.173通過(guò)pri-miR-195中的轉(zhuǎn)錄后減少來(lái)下調(diào)miRNA195表達(dá)來(lái)刺激腸上皮細(xì)胞更新。該過(guò)程通過(guò)直接RNA-RNA相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述相互作用增強(qiáng)pri-miR-195轉(zhuǎn)錄本的降解。

我們?cè)诨蚪M水平上研究了一類(lèi)新的lncRNA，即T-UCR我們鑒定了在抑制腸粘膜生長(zhǎng)期間差異表達(dá)的許多T-UCR，并證明T-UCR uc.173作為腸粘膜更新的生物刺激物起作用。我們的結(jié)果進(jìn)一步揭示了uc.173通過(guò)使pri-miR-195轉(zhuǎn)錄本去穩(wěn)定來(lái)增強(qiáng)腸粘膜的生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)代表了將T-UCR與腸粘膜更新聯(lián)系起來(lái)的主要概念進(jìn)展，并揭示了uc.173 / miRNA195軸對(duì)腸粘膜萎縮和適應(yīng)不良的發(fā)病機(jī)制的重要影響。

uc.173通過(guò)穩(wěn)定pri-miR-195轉(zhuǎn)錄本而不影響其基因轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)IEC中的miRNA195。uc.173直接與pri-miR-195相互作用并且特異性地增強(qiáng)其降解。

uc.173介導(dǎo)的miRNA195抑制具有生物學(xué)意義，可能提供創(chuàng)新的分子療法，以保護(hù)患有嚴(yán)重疾病的患者的粘膜上皮完整性?？傊?，我們的結(jié)果表明uc.173通過(guò)降低miRNA195豐度而作為腸粘膜更新的有效刺激物起作用。我們的研究還表明，通過(guò)RNA-RNA相互作用對(duì)pri-miRNA轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)控制代表了增強(qiáng)腸上皮再生的新型治療靶標(biāo)。

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