超保守lncRNA uc.372通過(guò)抑制miR-195/miR4668成熟來(lái)驅(qū)動(dòng)肝臟脂質(zhì)積聚

期刊：nature communications；影響因子：12.353

發(fā)表單位：北京醫(yī)院

超保守（uc）RNA是一類(lèi)長(zhǎng)的非編碼RNA（lncRNA），在人類(lèi)，小鼠和大鼠中是保守的，但ucRNA的生理學(xué)意義和病理作用在很大程度上是未知的。此前介紹過(guò)兩篇挑選超保守lncRNA，進(jìn)行功能研究的文章“RNAseq得到差異lncRNA那么多，該如何找到需要的lncRNA?”，作者根據(jù)lncRNA超保守區(qū)域找到一個(gè)lncRNA，在癌/睪丸中結(jié)合IGF2BP1形成復(fù)合物調(diào)控靶標(biāo)基因表達(dá)的機(jī)制（cell；IF：31.398）；“根據(jù)保守性挑選重要功能lncRNA”，lncRNA抑制miRNA生成促進(jìn)靶基因表達(dá)進(jìn)而引起腸上皮細(xì)胞快速更新(Gastroenterology；IF：20.773)。本研究同樣篩選超保守lncRNA,發(fā)現(xiàn)uc.372可以抑制miR-195/miR-4668生成，促進(jìn)靶基因（脂肪攝取、積聚相關(guān)基因）表達(dá)，驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪積累。

非酒精性脂肪性肝?。?/span>NAFLD）的致病原因復(fù)雜且多樣，目前研究主要集中在蛋白質(zhì)編碼基因上。越來(lái)越多的證據(jù)表明非編碼RNA通過(guò)機(jī)制發(fā)揮重要的生物學(xué)，發(fā)育和病理作用，包括增強(qiáng)子的順式調(diào)節(jié)，染色質(zhì)重編程和轉(zhuǎn)錄后水平的mRNA加工。

LncRNAs，特別是高度保守的，被假定為經(jīng)歷主動(dòng)調(diào)節(jié)并且可能具有細(xì)胞功能。一項(xiàng)全基因組調(diào)查確定481 lncRNA的長(zhǎng)度超過(guò)200 bp，在人類(lèi)，小鼠和大鼠基因組中具有100％的同一性。這些高度保守的lncRNA被稱(chēng)為超保守元件（UCEs）。超保守區(qū)域在DNA結(jié)合，RNA加工和轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用。最近，已經(jīng)表明轉(zhuǎn)錄的超保守RNA（ucRNA）的表達(dá)模式在許多人類(lèi)腫瘤中發(fā)生改變，表明它們可能參與癌癥進(jìn)展。本研究，我們提出了一種新的機(jī)制，uc.372通過(guò)抑制miR-195/miR-4668成熟來(lái)驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪變性，從而減輕miR-195/miR-4668介導(dǎo)的與脂質(zhì)合成相關(guān)的功能性靶基因的抑制，包括乙酰輔酶A羧化酶（ACC），脂肪酸合成酶（FAS），硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）和與脂質(zhì)攝取相關(guān)的基因如CD36，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累。

為了鑒定可能參與肝臟脂質(zhì)代謝的ucRNA，我們首先搜索了db/db小鼠肝臟中上調(diào)的ucRNA。 LncRNA范圍的表達(dá)分析鑒定出16種ucRNA，在db/db小鼠的肝臟中異常增加~6.1至~30.4倍，伴有肝臟脂質(zhì)積聚異常（圖1a）。我們通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析db/db小鼠肝臟中5個(gè)ucRNA（uc.348，uc.372，uc.94，uc.157和uc.436）顯著增加（n = 5）。此外，我們測(cè)定了高脂肪飲食（HFD）喂養(yǎng)小鼠肝臟中5 ucRNA的水平，發(fā)現(xiàn)uc.372，但不是uc.348，uc.94，uc.157和uc.436的水平，在這些小鼠的肝臟中增加了4.4±0.4倍并伴隨肝臟脂質(zhì)積聚異常。接下來(lái)，通過(guò)分析uc.372在各種組織中的分布，我們發(fā)現(xiàn)uc.372在小鼠器官中廣泛表達(dá)。在接受HFD的小鼠中，uc.372在代謝相關(guān)器官（包括肌肉，肝臟，心臟和脂肪）中的表達(dá)大量增加，意味著uc.372可能參與肝臟脂質(zhì)代謝。

接下來(lái)，我們假設(shè)肝臟uc.372上調(diào)可能導(dǎo)致異常的脂質(zhì)積累。小鼠過(guò)表達(dá)uc.372，Ad-中肝臟三甘油酯水平顯著升高，肝臟重量，肝臟重量與體重的比例，血清膽固醇和甘油三酯水平顯著增加。此外，我們通過(guò)northern印跡檢測(cè)了過(guò)表達(dá)小鼠不同組織中uc.372的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝臟中uc.372的高表達(dá)，但在其他組織中不表達(dá)。

敲低uc.372發(fā)現(xiàn)注射敲低小鼠的肝臟甘油三酯水平，肝臟重量，肝臟重量與體重的比率，血清膽固醇和甘油三酯水平顯著降低。

為了探索uc.372調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的潛在機(jī)制，過(guò)表達(dá)uc.372，評(píng)估了與脂質(zhì)合成（ACC，FAS，SCD，SREBP1和LXR），攝?。?/span>Fatp1，Fatp2，Fatp5，Fabp1和CD36），氧化（Cpt1a，Scad，Acox1和PPARα）和分泌（apoB和Mtp）相關(guān)的基因表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)uc.372的HepG2細(xì)胞，與脂質(zhì)合成相關(guān)的基因（包括ACC，FAS和SCD1）和與脂質(zhì)攝取相關(guān)的基因（如CD36）的表達(dá)上調(diào)。類(lèi)似地，小鼠肝臟中過(guò)表達(dá)uc.372導(dǎo)致acc，fas，scd1和cd36水平升高。

相反，敲低uc.372表達(dá)導(dǎo)致與脂質(zhì)合成相關(guān)的基因ACC，FAS，SCD1和CD36的mRNA和蛋白質(zhì)水平低得多。此外，小鼠肝臟敲低uc.372降低了acc，fas，scd1和CD36的表達(dá)。這些結(jié)果表明，uc.372通過(guò)促進(jìn)從頭脂肪生成和脂質(zhì)攝取來(lái)驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪積累。

為了理解uc.372調(diào)節(jié)ACC，FAS，SCD1和CD36表達(dá)的機(jī)制，原位雜交分析uc.372細(xì)胞分布。uc.372主要定位于細(xì)胞核（注，lnc的定位與功能相關(guān)）。uc.372表達(dá)的核/細(xì)胞質(zhì)比率分別為12.6和13.3，表明uc.372可能在細(xì)胞核中發(fā)揮其生物學(xué)功能。miRNAs和UCEs之間的相關(guān)性已被廣泛報(bào)道，為了鑒定uc.372的潛在的miRNA靶標(biāo)，我們?cè)?/span>HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)uc.372并進(jìn)行微陣列分析。陣列中存在的總共66種miRNA在uc.372轉(zhuǎn)染時(shí)表現(xiàn)出≥1.5倍的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)（過(guò)表達(dá)lnc后，做miRNA高通量篩選）。值得注意的是，pri-miR-195和pri-miR-4668顯示出與uc.372的超保守區(qū)域的互補(bǔ)性。

我們測(cè)定了uc.372抑制或過(guò)表達(dá)時(shí)pri-miR-195/pri-miR-4668，pre-miR-195/pre-miR-4668和miR-195/miR-4668的表達(dá)水平。uc.372的敲低觀察到顯著降低了pri-miR-195/pri-miR-4668和升高了pre-miR-195/pre-miR-4668和成熟的miR-195/miR-4668表達(dá)量。相反，uc.372的過(guò)表達(dá)增加了pri-miR-195/pri-miR-4668的水平并抑制了miR-195/miR-4668的成熟。為了破壞uc.372與這些miRNA之間的相互作用，我們構(gòu)建了突變體。當(dāng)該突變形式的uc.372過(guò)表達(dá)時(shí)，pri-miR-195/pri-miR-4668，pre-miR-195/pre-miR-4668和成熟miR-195/miR-4668表達(dá)沒(méi)有變化。用針對(duì)Drosha的抗體進(jìn)行RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）測(cè)定，uc.372的過(guò)表達(dá)顯著增加免疫沉淀的RNA中針對(duì)Drosha的抗體中pri-miR-195/pri-miR-4668的水平。

基于TargetScan，預(yù)測(cè)SCD1和CD36可能是miR-4668的靶基因（此處要挑選與脂肪形成相關(guān)的基因作為靶基因）。我們測(cè)定了用O/P混合物處理的HepG2細(xì)胞中miR-4668的表達(dá)，并且觀察到與對(duì)照相比，O/P處理的HepG2細(xì)胞中miR-4668的表達(dá)降低（補(bǔ)充圖6c）。為了證實(shí)SCD1和CD36是miR-4668的真正靶標(biāo)，將含有miR-4668結(jié)合位點(diǎn)的這些基因的3'非翻譯區(qū)（UTR）克隆到pmirGLO質(zhì)粒中以評(píng)估熒光素酶活性。miR-4668顯著抑制pmirGLO-SCD1-3'UTR或pmirGLO-CD36-3'UTR的相對(duì)熒光素酶單位。 總之，這些數(shù)據(jù)證明uc.372通過(guò)結(jié)合pri-miR-195/pri-miR-4668特異性抑制miR-195/miR-4668表達(dá)以減輕miR-195/miR-4668介導(dǎo)的抑制。功能性靶基因如ACC，FAS，SCD1和CD36，導(dǎo)致肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。

我們接下來(lái)試圖了解uc.372的轉(zhuǎn)錄是如何被調(diào)節(jié)的。通過(guò)分析uc.372的序列，我們發(fā)現(xiàn)它由277個(gè)核苷酸（nt）組成，這些核苷酸在物種間高度保守。uc.372超保守區(qū)位于RALGAPA1基因的內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)，并且位于14號(hào)染色體上胰島素瘤相關(guān)2基因（INSM2）下游1400bp處。為了探索RALGAPA1，INSM2和uc.372轉(zhuǎn)錄之間可能的相互關(guān)系，首先通過(guò)實(shí)時(shí)PCR在db/db小鼠和HFD喂養(yǎng)的小鼠的肝臟中評(píng)估RALGAPA1和INSM2的mRNA水平。結(jié)果表明，在這些動(dòng)物模型的肝臟中RALGAPA1和INSM2的表達(dá)均增加。在用300μMO/ P混合物處理的HepG2細(xì)胞中，RALGAPA1和INSM2的mRNA水平也增強(qiáng)。此外，盡管RALGAPA1 mRNA水平降低了71-78％，但在用針對(duì)RALGAPA1的siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中未鑒定出uc.372表達(dá)的變化。然而，在用靶向INSM2的siRNA處理的HepG2細(xì)胞中，uc.372表達(dá)顯著下調(diào)。這些觀察結(jié)果表明INSM2可能參與了uc.372的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

鑒于uc.372的轉(zhuǎn)錄依賴(lài)于INSM2，我們繼續(xù)探索調(diào)節(jié)該過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)基因調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html）確定了六種靶向uc.372的轉(zhuǎn)錄因子。如實(shí)時(shí)PCR分析所示，上游轉(zhuǎn)錄因子1（USF1）的表達(dá)在db/db和HFD喂養(yǎng)的小鼠的肝臟中升高。我們還觀察到用O/P混合物處理的HepG2細(xì)胞中USF1的水平顯著增加。USF1與INSM2的一致表達(dá)模式提高了USF1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)INSM2表達(dá)的可能性。過(guò)表達(dá)USF1的細(xì)胞顯示出uc.372和INSM2的mRNA水平顯著增強(qiáng)，但不顯示NOX2的陰性對(duì)照。此外，USF1的過(guò)表達(dá)還導(dǎo)致ACC，FAS，SCD1和CD36的蛋白質(zhì)水平顯著增加。相反，降低USF1表達(dá)降低了uc.372和INSM2的mRNA水平，但沒(méi)有降低NOX2的陰性對(duì)照和ACC，FAS，SCD1和CD36的蛋白質(zhì)水平。uc.372的抑制顯著減弱了USF1介導(dǎo)的ACC，FAS，SCD1和CD36表達(dá)的誘導(dǎo)?；谶@些數(shù)據(jù)，我們提出USF1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)INSM2和uc.372的表達(dá)，從而在肝細(xì)胞中表達(dá)ACC，FAS，SCD1和CD36的表達(dá)。

我們接下來(lái)通過(guò)調(diào)節(jié)pri-miR-195/pri-miR-4668處理，檢查uc.372是否在功能上參與了NAFLD患者的異常肝臟脂質(zhì)積聚。除了異常的脂質(zhì)積累，我們還觀察到NAFLD患者中肝uc.372表達(dá)的顯著上調(diào)。微陣列轉(zhuǎn)錄組分析顯示，NAFLD患者的肝臟中脂質(zhì)代謝途徑和uc.372表達(dá)異常改變。這促使我們使用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)一步檢查與脂肪生成和脂質(zhì)攝取相關(guān)的基因。我們確認(rèn)在NAFLD患者的肝臟中ACC，FAS，SCD1和CD36的水平顯著升高。一致地，我們發(fā)現(xiàn)肝INSM2和USF1表達(dá)的顯著增強(qiáng)，支持USF1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)NAFLD患者肝臟中INSM2和uc.372表達(dá)的觀點(diǎn)。隨后，我們分析了這些患者中pri-miR-195/pri-miR-4668和成熟miR-195/miR-4668的肝臟水平。有趣的是，我們觀察到NAFLD患者肝臟中pri-miR-195/pri-miR-4668的增加和miR-195/miR-4668表達(dá)的減少。這些結(jié)果證實(shí)uc.372的脂質(zhì)積累作用受NAFLD患者的脂肪肝中miR-195/miR-4668的調(diào)節(jié)（圖8）。

最近，ucRNA被鑒定為一類(lèi)高度保守的lncRNAs，但是對(duì)ucRNAs的生理意義和潛在病理作用的清晰認(rèn)識(shí)仍然是難以捉摸的。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，uc.372通過(guò)抑制miR-195/miR-4668的成熟來(lái)驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪變性，從而減輕靶基因的抑制，包括ACC ，F(xiàn)AS，SCD1和CD36。我們還提出uc.372抑制劑可能是NAFLD的潛在治療藥物。未來(lái)的主要目標(biāo)是研究這種lncRNA在不同代謝相關(guān)器官中的潛在功能作用，以維持脂質(zhì)體內(nèi)平衡。

微信掃描二維碼關(guān)注公眾號(hào)回復(fù)數(shù)字 “187181” 下載文獻(xiàn)原文，完整譯文