A newly identi?ed lncRNA MAR1 acts as a miR-487b sponge to promote skeletal muscle differentiation and regeneration

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A newly identi?ed lncRNA MAR1 acts as a miR-487b sponge to promote skeletal muscle differentiation and regeneration

新鑒定的lncRNA MAR1充當(dāng)miR-487b海綿吸附，促進(jìn)骨骼肌分化和再生

期刊：J Cachexia Sarcopenia Muscle；影響因子：12.511

發(fā)表單位：香港中文大學(xué)

導(dǎo) 讀

lncRNA/circRNA等可以作為競爭性內(nèi)源RNA起到海綿吸附miRNA進(jìn)而減弱miRNA對其靶基因的抑制作用。研究ceRNA機制，通過測序或芯片找到差異的重要的lnc/circ（除了做實驗，還可以怎么找？），預(yù)測其結(jié)合的miRNA，預(yù)測miRNA結(jié)合的靶基因（小注：該靶基因一定要在該生物學(xué)中發(fā)揮重要作用，是轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控分子，影響力大）。該文章是lncRNA ceRNA機制研究很好的范本。

摘要

背景：老化（肌肉減少癥）或力學(xué)失負(fù)荷引起的骨骼肌萎縮與嚴(yán)重的健康后果相關(guān)。長鏈非編碼RNA（lncRNA）被認(rèn)為是許多生理和病理過程中的重要調(diào)節(jié)劑。

方法：進(jìn)行微陣列分析以鑒定成年和老年小鼠之間骨骼肌中差異表達(dá)的lncRNA。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測lncRNA的靶microRNA和microRNA的靶蛋白，并在體外進(jìn)行驗證。此外，通過過表達(dá)或敲低lncRNA來研究體內(nèi)lncRNA的生物學(xué)功能。評估了lncRNA過表達(dá)在年齡相關(guān)或力學(xué)失負(fù)荷導(dǎo)致的肌肉萎縮中的治療效果。

結(jié)果：一種新lncRNA MAR1在小鼠骨骼肌中高表達(dá)，microRNA-487b（miR-487b）是MAR1的直接靶標(biāo)。Wnt5a，一種在肌生成過程中的重要調(diào)節(jié)因子，是C2C12細(xì)胞中miR-487b的靶標(biāo)。結(jié)果證明，成肌細(xì)胞中MAR1的過表達(dá)導(dǎo)致Wnt5a的去阻遏。此外，MAR1促進(jìn)骨骼肌質(zhì)量/強度和Wnt5a蛋白水平。MAR1過表達(dá)減弱了由衰老或去負(fù)荷誘導(dǎo)的肌肉萎縮。

結(jié)論：新鑒定的lncRNA MAR1可作為miR-487b海綿吸附調(diào)節(jié)Wnt5a蛋白，從而促進(jìn)肌肉分化和再生。 MAR1可能是治療老化或力學(xué)失負(fù)荷引起的肌肉萎縮的新型治療靶點。

研究背景

骨骼肌分化受多種信號傳導(dǎo)通路的影響。肌源性調(diào)節(jié)因子（MRFs），包括MyoD，Myf5和肌細(xì)胞生成素，是肌源性通路的核心成分，這些MRF及其共調(diào)節(jié)因子肌細(xì)胞增強因子2C（MEF2C）在肌肉生成過程中起重要作用。Wingless型（Wnt）信號控制MRFs的表達(dá)。Wnt5a是Wnt家族成員，在肌細(xì)胞生成過程中調(diào)節(jié)MyoD和Myf5。但是，骨骼肌萎縮的分子機制仍需要進(jìn)行廣泛的探索。lncRNAs在骨骼肌萎縮中的病理作用，特別是由衰老或力學(xué)失負(fù)荷引起的，仍然是未知的。本研究目的是探討lncRNA在由衰老或力學(xué)失負(fù)荷誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮期間調(diào)節(jié)肌肉分化中的作用。

研究結(jié)果

小鼠衰老和力學(xué)失負(fù)荷過程中lncRNA MAR1表達(dá)與肌肉質(zhì)量的正相關(guān)

利用lncRNA微陣列比較成年（6個月大，n = 3）和老年小鼠（24個月大，n = 3）之間腓腸肌中差異表達(dá)的lncRNA。641nt長的lncRNA（AK087875）被鑒定為下調(diào)低的lncRNA。將此lncRNA命名為MAR1。PCR顯示，在成年小鼠中，骨骼肌中MAR1的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他組織/器官中的表達(dá)水平（n = 10）（圖1B）。在不同的骨骼肌中，腓腸肌中的MAR1是豐富的（圖1C）。相關(guān)性分析顯示，肌肉生長和衰老過程中MAR1表達(dá)與M/B比值呈正相關(guān)（圖1F）。此外，骨骼肌中MAR1的表達(dá)水平在力學(xué)失負(fù)荷期間下調(diào)并且在重新負(fù)荷期間恢復(fù)（n = 10）（圖1G）。在失負(fù)荷和重新負(fù)荷的小鼠中，M/B比率顯示與MAR1的表達(dá)水平類似的變化模式（圖1H）。相關(guān)性分析還顯示當(dāng)力學(xué)負(fù)荷改變時MAR1水平和M/B比之間正相關(guān)（圖1I）。

MAR1在體外促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞的肌原性分化

在C2C12成肌細(xì)胞的肌原性分化期間MAR1增加，這與肌原性標(biāo)志物（MyoD和MyoG）的表達(dá)水平的變化一致。我們構(gòu)建了編碼MAR1或MAR1 shRNA的慢病毒載體。在C2C12細(xì)胞中過表達(dá)MAR1顯著增強肌原性標(biāo)記物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）的mRNA和蛋白質(zhì)水平以及肌管的形成，而MAR1 shRNA降低了上述mRNA和蛋白質(zhì)水平以及肌管的形成。

預(yù)測和驗證miR-487b作為C2C12細(xì)胞中MAR1的靶miRNA之一

為了進(jìn)一步了解MAR1調(diào)節(jié)肌肉分化的機制，使用RNAhybrid 2.12預(yù)測microRNA-487b是MAR1的靶miRNA之一。進(jìn)一步揭示生物素標(biāo)記的MAR1在miR-487b轉(zhuǎn)染的C2C12細(xì)胞中以劑量依賴性方式特異性地降低miR-487b。然后，我們將含有野生型結(jié)合位點（miR-487b-WT）或突變結(jié)合位點（miR-487b-Mut）的miR-487b克隆到熒光素酶報告基因的下游。結(jié)果表明，MAR1轉(zhuǎn)染可降低miR-487b-WT的熒光素酶活性，但不影響miR-487b-Mut的熒光素酶活性。同時，含有突變結(jié)合位點的MAR1的轉(zhuǎn)染不能降低miR-487b-WT或miR-487b-Mut的熒光素酶活性。

預(yù)測和驗證Wnt5a作為C2R12細(xì)胞中miR-487b的靶標(biāo)

Wnt5a是生肌過程中的重要調(diào)節(jié)因子，被報道為肺癌細(xì)胞中miR-487b的靶標(biāo)之一。在CaC5細(xì)胞中，Wnt5a通過agomiR-487b（miR-487b激動劑）在蛋白質(zhì)水平下調(diào)，而antagomiR-487b（miR-487b抑制劑）使Wnt5a蛋白表達(dá)升高。通過RNAhybrid 2.12預(yù)測Wnt5a在其3'非翻譯區(qū)（UTR）中具有miR-487b結(jié)合位點。我們構(gòu)建了熒光素酶報告基因。熒光素酶報告基因測定顯示agomiR-487b（含有Wnt5a野生型結(jié)合位點的agomiR-487b），可降低Wnt5a 3'UTR的熒光素酶活性，但含agomiR-487b-Mut（含有Wnt5a突變結(jié)合位點的agomiR-487b）的不能。

MAR1促進(jìn)C2C12細(xì)胞中Wnt5a蛋白的表達(dá)水平

我們發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中肌肉分化期間Wnt5a蛋白質(zhì)增加。相關(guān)性分析顯示，在分化期間，Wnt5a蛋白的表達(dá)水平與C2C12細(xì)胞中的MAR1水平正相關(guān)。在C2C12細(xì)胞中MAR1過表達(dá)顯著增強Wnt5a蛋白表達(dá)，而agomiR-487b可以消除升高的Wnt5a蛋白表達(dá)。MAR1 shRNA感染降低了C2C12細(xì)胞中Wnt5a蛋白的表達(dá)，并且antagomiR-487b可以挽救Wnt5a蛋白表達(dá)的減少。

MAR1促進(jìn)小鼠骨骼肌質(zhì)量/強度和Wnt5a蛋白水平

我們通過肌肉注射肌肉特異性MAR1過表達(dá)或低表達(dá)慢病毒進(jìn)一步操縱成年小鼠（n = 10）中的MAR1表達(dá)。MAR1過表達(dá)增強了腓腸肌質(zhì)量和肌纖維CSA。與對照組相比，MAR1過表達(dá)小鼠的肌肉也產(chǎn)生顯著更高的力。此外，MAR1過表達(dá)小鼠的肌肉中肌原性標(biāo)志物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）蛋白，Wnt5a蛋白，mRNA的表達(dá)水平升高。另一方面，腓腸肌中的MAR1 shRNA感染減少了肌肉量和纖維CSA。在MAR1 shRNA感染后，肌肉產(chǎn)生的力也被抑制。此外，MAR1 shRNA感染下調(diào)小鼠肌肉中Wnt5a蛋白，mRNA，肌原性標(biāo)志物的蛋白水平。

MAR1過表達(dá)減弱老年小鼠的肌肉萎縮

為了測試骨骼肌中MAR1過表達(dá)是否可以抵消與年齡相關(guān)的肌肉萎縮，22個月大的小鼠肌內(nèi)注射肌肉特異性MAR1過表達(dá)慢病毒。與基線和年齡匹配的對照組相比，MAR1過表達(dá)組中MAR1的表達(dá)水平顯著更高。老年組腓腸肌質(zhì)量和平均肌纖維CSA均較基線組降低，而MAR1組則增強。此外，我們進(jìn)行了原位肌肉功能測試。結(jié)果顯示，老年組腓腸肌的強度比基線組弱，而MAR1組產(chǎn)生的力比其他兩組高。此外，Wnt5a蛋白水平，mRNA和肌原性標(biāo)志物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）蛋白水平顯示出與肌肉質(zhì)量和強度參數(shù)相似的變化。

MAR1過表達(dá)減弱后肢懸?。?/span>HS）小鼠的肌肉萎縮

小鼠在28天HS之前肌內(nèi)注射肌肉特異性MAR1過表達(dá)慢病毒。在28天HS后，HS組的MAR1水平顯著低于基線組，而MAR1組的MAR1水平略高于基線組。MAR1組的肌肉質(zhì)量和平均肌纖維CSA顯著高于HS組，接近基線組水平。原位肌肉功能測試的結(jié)果顯示，MAR1組中力學(xué)失負(fù)荷誘導(dǎo)的肌肉無力有效減弱。類似地，MAR1組恢復(fù)了降低的Wnt5a蛋白水平、mRNA和肌源性標(biāo)志物（MyoD，MyoG，Mef2c和Myf5）的蛋白質(zhì)水平。

討論

在這項研究中，我們在小鼠骨骼肌中鑒定出一種新的lncRNA MAR1，起到促進(jìn)骨骼肌分化和再生的miR-487b海綿吸附的作用，這可能是治療由衰老或力學(xué)失負(fù)荷引起的肌肉萎縮的新型治療靶點。已經(jīng)報道了一種新的調(diào)節(jié)機制，其中lncRNA可以作為競爭性內(nèi)源RNA起到海綿吸附miRNA的作用，從而調(diào)節(jié)miRNA靶標(biāo)的去阻遏并施加額外水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在目前的研究中，當(dāng)MAR1在C2C12細(xì)胞中被敲低或過表達(dá)時，miR-487b的表達(dá)被上調(diào)或下調(diào)，導(dǎo)致Wnt5a蛋白水平和肌生成分別降低或增加。這些數(shù)據(jù)表明MAR1可能與miR-487b相互作用以轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)Wnt5a蛋白。