Long noncoding RNA LINC01234 functions as a competing endogenous RNA to regulate CBFB expression by sponging miR-204-5p in gastric cancer

長鏈非編碼RNA LINC01234作為競爭性內(nèi)源RNA起作用，通過海馬中miR-204-5p的表達(dá)來調(diào)節(jié)CBFB的表達(dá)

期刊：Clinical Cancer Research；影響因子：10.199   

發(fā)表單位：南京醫(yī)科大學(xué)                                 

    細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的lncRNA常見的作用機(jī)制是結(jié)合miRNA進(jìn)而調(diào)控靶基因發(fā)揮ceRNA機(jī)制，上一篇微文“這篇lncRNA ceRNA機(jī)制如何發(fā)到 IF12分的”介紹了lncRNA MAR1可作為miR-487b海綿吸附調(diào)節(jié)Wnt5a蛋白，從而促進(jìn)肌肉分化和再生（IF：12.511），本次繼續(xù)加深理解。ceRNA研究思路比較清楚，找到重要的lncRNA，確定其細(xì)胞定位（細(xì)胞質(zhì)），軟件預(yù)測結(jié)合的miRNA，而后預(yù)測miRNA結(jié)合的靶基因。正在做lncRNA，ceRNA機(jī)制的老師常會(huì)發(fā)現(xiàn)，軟件預(yù)測的miRNA, mRNA非常之多。如果可以借助其他數(shù)據(jù)（也可自己篩選），篩選出差異表達(dá)的miRNA，mRNA，而后選擇，將更有針對性。本研究將數(shù)據(jù)庫資源運(yùn)用的好，如何使用已有資料，也可參考“重磅: TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA數(shù)據(jù)挖掘（含分析結(jié)果）”。

    目的：長鏈非編碼RNA（lncRNA）已成為多種人類疾?。òò┌Y）的重要調(diào)節(jié)因子。然而，大多數(shù)lncRNA在胃癌發(fā)生中的整體生物學(xué)作用和臨床意義尚不完全清楚。

    實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：首先，我們通過分析從癌癥基因組圖譜（TCGA）獲得的測序數(shù)據(jù)，分析了胃癌和癌旁組織中LINC01234的改變。接下來，我們評估了LINC01234對GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以及通過充當(dāng)ceRNA對miR-204-5p的調(diào)節(jié)。動(dòng)物模型用于支持體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)LINC01234在胃癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且與較大的腫瘤大小，晚期TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較短的存活時(shí)間相關(guān)。此外，LINC01234的敲低在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和生長停滯，并抑制小鼠異種移植物中的腫瘤發(fā)生。機(jī)理研究表明，LINC01234作為miR-204-5p的ceRNA起作用，從而導(dǎo)致其內(nèi)源性靶核心結(jié)合因子β（CBFB）的去阻遏。 

    結(jié)論：LINC01234在GC中顯著過表達(dá)，LINC01234-miR-204-5p-CBFB軸在GC腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用。我們的研究結(jié)果可能為胃癌診斷和治療提供潛在的新靶點(diǎn)。

    由于高發(fā)病率和缺乏有效療法的結(jié)合，胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。   

    長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類ncRNA，其轉(zhuǎn)錄長度超過200個(gè)核苷酸。大量研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了幾個(gè)重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，包括X染色體印記，干細(xì)胞分化，免疫反應(yīng)，癌細(xì)胞增殖和化療耐藥。通常，lncRNA通過調(diào)節(jié)表觀遺傳，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的潛在靶基因表達(dá)來發(fā)揮其功能。過表達(dá)的lncRNA LINC00673通過海綿吸附miR-150-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，遷移，侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。HOTAIR還通過作為miR-126的競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）起作用來調(diào)節(jié)胃癌中的順鉑耐藥性。在本研究中，我們鑒定了一種位于12q24.13的新的與胃癌相關(guān)的lncRNA LINC01234，尚未發(fā)現(xiàn)LINC01234在癌癥中的生物學(xué)功能和表達(dá)模式。

    為了鑒定可能涉及胃腫瘤發(fā)生的胃癌相關(guān)的lncRNA，我們分析TCGA的376個(gè)STAD組織（腫瘤組）和33個(gè)相鄰的非腫瘤組織（正常組）的RNA測序數(shù)據(jù)。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)LINC01234在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于非腫瘤組織（圖1A）。然后，從GEO中分析另外三個(gè)基因譜分析數(shù)據(jù)（GSE13911，GSE70880和GSE99416）證實(shí)，與正常組織相比，LINC01234在胃癌組織中高表達(dá)（補(bǔ)充圖1A）。原位雜交（ISH）測定也顯示胃癌組織顯示LINC01234高表達(dá)（圖1B）。此外，qRT-PCR測量50對胃癌組織，胃癌細(xì)胞系（BGC823，SGC7901，MGC803，AGS和HGC27）和正常胃上皮細(xì)胞GES-1中LINC01234的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胃癌組織和癌細(xì)胞中LINC01234的表達(dá)顯著增加（圖1C和D）。

    為了評估LINC01234臨床意義，與患者臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。將50名患者分析顯示高LINC01234表達(dá)與較大腫瘤大?。?/span>P = 0.047），侵襲深度（P = 0.021 *）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P = 0.009）和TNM分期（P = 0.031 *）顯著相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示，LINC01234水平較高的患者的總生存期和無進(jìn)展生存期短于LINC01234水平較低的患者（圖1E和F）。

    為了研究LINC01234在胃癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，我們通過用siRNA，短發(fā)夾RNA（shRNA）載體或過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在SGC7901和BGC823細(xì)胞中敲低或過表達(dá)LINC01234（圖2A和B）。由CCK8增殖測定產(chǎn)生的生長曲線顯示LINC01234敲低顯著抑制SGC7901和BGC823細(xì)胞增殖，而LINC01234過表達(dá)促進(jìn)SGC7901和BGC823細(xì)胞生長能力。

    細(xì)胞凋亡增加和細(xì)胞周期停滯是導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖的兩個(gè)因素。流式細(xì)胞儀檢測和Tunel染色顯示si-LINC01234轉(zhuǎn)染的SGC7901和BGC823細(xì)胞也顯示細(xì)胞周期停滯。與用亂序siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，顯著更多的細(xì)胞處于G1/G0期，并且更少的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的G2/S期。此外，耗盡LINC01234的細(xì)胞表達(dá)顯著更高水平的凋亡相關(guān)蛋白，包括切割的Caspase-3，切割的PARP，Bak和Bax。

    為了確定LINC01234是否影響體內(nèi)腫瘤生長，用對照載體或靶向LINC01234的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，并皮下接種到雄性裸鼠中。由表達(dá)sh-LINC01234的細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤的平均大小和重量顯著小于從對照細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤。sh-LINC01234腫瘤中增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)低于對照腫瘤。Tunel染色顯示，sh-LINC0123腫瘤表現(xiàn)出更多的凋亡細(xì)胞?？傊?，這些結(jié)果證實(shí)了LINC01234在體內(nèi)胃癌中的致癌活性。

    近期的研究表明，lncRNAs可以作為miRNA的ceRNAs來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。為了研究LINC01234促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們首先使用FISH和亞細(xì)胞分離分析其分布。結(jié)果顯示LINC01234在細(xì)胞質(zhì)中更豐富，表明LINC01234可能在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶標(biāo)表達(dá)。實(shí)際上，胃癌細(xì)胞提取物的RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀測定顯示LINC01234直接結(jié)合Ago2，Ago2是參與miRNA介導(dǎo)的mRNA抑制的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物的組分。該發(fā)現(xiàn)表明LINC01234可以作為miRNA的ceRNA起作用。為了確定這一假設(shè)，我們使用在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（DIANA Tools）并觀察到LINC01234序列含有潛在的miR-148a-5p，miR-204-5p，miR-30d-3p，miR-33b-5p，miR-29c-5p和miR-193a-5p結(jié)合位點(diǎn)。然后我們進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告分析以確認(rèn)預(yù)測分析。miR-204-5p的抑制熒光能力更強(qiáng)。然后，GEO、TCGA miRNA分析，發(fā)現(xiàn)miR-204-5p，miR-30d-3p，miR-33b-5p和miR-29c-5p在胃組織中下調(diào)，并且miR-204-5p顯示出最高的倍數(shù)變化。值得注意的是，LINC01234敲低顯著增加了miR-204-5p的表達(dá)水平（圖4G），然而，miR-204-5p的過表達(dá)對LINC01234表達(dá)水平?jīng)]有影響。

    為了確定miR-204-5p是否在胃癌細(xì)胞中起腫瘤抑制劑的作用，發(fā)現(xiàn)miR-204-5p過表達(dá)顯著降低細(xì)胞增殖和集落形成能力，miR-204-5p低表達(dá)時(shí)顯著增強(qiáng)。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示miR-204-5p的過表達(dá)誘導(dǎo)SGC7901和BGC823細(xì)胞中G1-G0期的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示miR-204-5p水平較高的患者總生存期較低水平。此外，miR-204-5p的過表達(dá)抑制了體內(nèi)胃癌細(xì)胞的腫瘤生長。

    為了確定LINC01234，miR-204-5p及其在胃癌中的靶標(biāo)之間的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，我們使用TargetScan和miRanda來預(yù)測潛在的miR-204-5p靶基因。接下來，TCGA數(shù)據(jù)預(yù)測LINC01234-miR-204-5p靶向ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)CBFB，UBA2等基因可能涉及該網(wǎng)絡(luò)。然后，我們對LINC01234下調(diào)SGC7901細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了RNA-seq分析，結(jié)果表明，敲低LINC01234可明顯降低一系列促進(jìn)胃癌增殖的基因。有趣的是，CBFB是最常改變基因之一，因此選擇CBFB用于胃癌的進(jìn)一步分析。計(jì)算機(jī)分析顯示CBFB的3'UTR（2131-2151個(gè)核苷酸）含有潛在的miR-204-5p結(jié)合位點(diǎn)。

    由于LINC01234可以結(jié)合miR-204-5p，我們接下來確定LINC01234是否可以通過結(jié)合miR-204-5p中的相同位點(diǎn)來調(diào)節(jié)CBFB的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)LINC01234的敲低也顯著降低了SGC7901和BGC823細(xì)胞中的CBFB mRNA和蛋白質(zhì)水平。miR-204-5p抑制劑有效地逆轉(zhuǎn)了由si-LINC01234 2＃引起的CBFB蛋白水平的抑制。然后，分析20對胃癌組織中LINC01234和CBFB表達(dá)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LINC01234和CBFB之間存在正相關(guān)，與LINC01234-miR-204-5p-CBFB調(diào)節(jié)軸的存在一致。

    為了研究CBFB在胃癌中的致癌作用，我們首先分析了其在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，通過TCGA測序數(shù)據(jù)分析，CBFB在胃癌樣品中比癌旁組織增加。類似地，人胃癌組織的免疫組織化學(xué)染色顯示胃癌樣品中CBFB蛋白豐度增加。重要的是，較高的CBFB表達(dá)與胃癌患者較短的總生存時(shí)間顯著相關(guān)。CBFB表達(dá)的敲低顯著降低細(xì)胞生長活力。此外，CBFB的敲低可抑制體內(nèi)胃癌細(xì)胞的腫瘤生長。

    越來越多的報(bào)道表明存在一個(gè)涉及ceRNA的新型和廣泛的相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中lncRNA可以通過結(jié)合miRNA并將其從蛋白質(zhì)編碼mRNA結(jié)合位點(diǎn)分離。例如，lncRNA HOXA11-AS通過作為miR-1297的ceRNA而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖; lncRNA Unigene56159通過作為miR-140-5p的ceRNA促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在這項(xiàng)研究中，我們確定LINC01234主要定位于細(xì)胞質(zhì)中并且可以與胃癌細(xì)胞中的Ago2相互作用，這表明LINC01234可以作為內(nèi)源miRNA起海綿吸附作用。

微信掃描二維碼關(guān)注公眾號回復(fù)數(shù)字 “188221” 下載文獻(xiàn)原文，完整譯文