LncRNA lnc-RI regulates homologous recombination repair of DNA double-strand breaks by stabilizing RAD51 mRNA as a competitive endogenous RNA

LncRNA lnc-RI通過穩(wěn)定RAD51 mRNA作為競爭性內(nèi)源RNA來調(diào)節(jié)DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)

期刊：Nucleic Acids Research；影響因子：11.561

發(fā)表單位：北京理工大學(xué)           

    LncRNA調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)，無孔不入，幾乎參與各種生物學(xué)過程，本研究發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂修復(fù)過程中，lnc-RI競爭性結(jié)合miR-193a-3p促進(jìn)RAD51表達(dá)發(fā)揮DNA雙鏈斷裂修復(fù)。                

    DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)對于維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。目前DSB修復(fù)機(jī)制的模型基于DNA修復(fù)蛋白的研究。我們發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導(dǎo)的lncRNA，lnc-RI的表達(dá)與人外周血淋巴細(xì)胞中的微核頻率呈負(fù)相關(guān)。抑制lnc-RI顯著增加自發(fā)性DSB水平，這被證實與DSB的同源重組（HR）修復(fù)效率降低有關(guān)。我們證明了miR-193a-3p可以與lnc-RI和RAD51 mRNA結(jié)合并抑制lnc-RI和RAD51 mRNA的表達(dá)。Lnc-RI作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）通過與miR-193a-3p的競爭性結(jié)合和釋放其對RAD51表達(dá)的抑制來穩(wěn)定RAD51 mRNA。               

    修復(fù)DNA損傷的異常是基因組不穩(wěn)定的重要原因。 DNA雙鏈斷裂（DSBs）被認(rèn)為是細(xì)胞壽命期間基因組完整性中最具災(zāi)難性的變化，通常由復(fù)制應(yīng)激，基因毒性化學(xué)物質(zhì)，電離輻射暴露，炎癥等疾病引起。長非編碼RNA（lncRNA）是一組非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物。LncRNAs在許多細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞凋亡，發(fā)育，干細(xì)胞多能性，肌肉分化和癌發(fā)生。根據(jù)競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）假說，特定RNA可作為miRNA海綿，以控制這些miRNA靶向的其他轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，而lncRNAs是ceRNA串?dāng)_過程的必要組成部分。我們的結(jié)果表明miR-193a-3p靶向RAD51和lnc-RI，并且lnc-RI通過與miR-193a-3p競爭性結(jié)合并且重新抑制其對RAD51 mRNA的抑制來調(diào)節(jié)RAD51 mRNA的穩(wěn)定性。我們的研究結(jié)果揭示了lnc-RI通過lnc-RI/miR-193a-3p/RAD51 mRNA 3’UTR軸調(diào)節(jié)HR途徑的新機(jī)制。                     

    微核通過染色體斷裂或損失在有核細(xì)胞中形成，并且通常被認(rèn)為是基因組不穩(wěn)定性的生物標(biāo)志物。我們以前的發(fā)現(xiàn)表明，lnc-RI是一種輻射誘導(dǎo)的lncRNA分子，參與輻射誘導(dǎo)的DDRs。因此，我們假設(shè)lnc-RI與基因組完整性相關(guān)。為了驗證這一假設(shè)，我們首先研究了21個健康供體的外周血淋巴細(xì)胞中lnc-RI表達(dá)與微核率之間的潛在關(guān)系。使用胞質(zhì)分裂阻滯（CB）微核的實時PCR分析lnc-RI表達(dá)水平和微核率分析的結(jié)果如表1所示。圖1的數(shù)據(jù)表明微核頻率與lnc-RI表達(dá)負(fù)相關(guān)，這暗示lnc-RI可能涉及維持基因組穩(wěn)定性。

    我們之前的研究表明，一些DDR相關(guān)基因的表達(dá)在lnc-RI敲低細(xì)胞中被破壞。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)lnc-RI的啟動子含有NF-κB（p65）結(jié)合位點（在+71bp和+81bp之間）。然后我們證實lnc-RI可能通過NF-κB（p65）依賴性方式的輻射誘導(dǎo)。接下來，我們發(fā)現(xiàn)lnc-RI敲低可能使HeLa細(xì)胞對輻射敏感。DNA雙鏈斷裂。與siRNA-NC相比，siRNA-Inc-RI＃1和＃2有效抑制lnc-RI的表達(dá)，顯著增加γ-H2AX和γ-H2AX灶形成。在MCF-7和LO2細(xì)胞中觀察到類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，敲低lnc-RI表達(dá)顯著增加自發(fā)性DSB的積累。

在進(jìn)一步的研究中，進(jìn)行中性彗星試驗以檢測轉(zhuǎn)染特異性siRNA后24小時或48小時HeLa和U2OS細(xì)胞中DSB的產(chǎn)量。在用lnc-RI特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中DNA片段顯著增加。我們證實，lnc-RI的敲低增加了多種細(xì)胞類型中的自發(fā)DSB水平。

    我們使用在U2OS細(xì)胞中充分表征的HR報告基因測定（DR-GFP）研究了lnc-RI對DSB的HR活性的影響。與對照細(xì)胞相比，lnc-RI敲低導(dǎo)致GFP信號顯著降低，表示I-Sce I在報道構(gòu)建體中產(chǎn)生的DSB的HR修復(fù)效率。

接下來，我們嘗試鑒定lnc-RI的靶標(biāo)，其中lnc-RI調(diào)節(jié)HR活性，HR途徑中幾種必需蛋白的表達(dá)（MRE11，RAD50，NBS1，RAD51，BRCA1，BRCA2，PLK1和BCL2）是通過WB印跡檢測。HeLa和U2OS細(xì)胞中lnc-RI的敲低顯著抑制RAD51和PLK1表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)一些HR途徑相關(guān)蛋白（RAD50，BRCA1，BRCA2）的表達(dá)在一定程度上被抑制。接下來，我們在lnc-RI敲低細(xì)胞中過量表達(dá)RAD51和PLK1，僅過表達(dá)RAD51可以減弱由lnc-RI敲低誘導(dǎo)的γ-H2AX水平。

上述所有證據(jù)表明，RAD51是一個關(guān)鍵目標(biāo)，通過該目標(biāo)，lnc-RI在HR途徑中發(fā)揮作用，并為我們提供一個線索，即lnc-RI可以調(diào)節(jié)RAD51表達(dá)作為ceRNA。

    進(jìn)一步研究了由lnc-RI敲低誘導(dǎo)RAD51抑制的機(jī)制。RNA介導(dǎo)的HeLa和U2OS細(xì)胞中的lnc-RI敲低導(dǎo)致蛋白質(zhì)和mRNA水平的RAD51表達(dá)降低。接下來，我們研究了lnc-RI調(diào)節(jié)RAD51 mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力。用LV-KD-Inc-RI感染HeLa細(xì)胞。在加入環(huán)己酰亞胺（CHX）以阻斷翻譯后1,2,4,8和12小時的Western印跡分析表明，lnc-RI敲低對RAD51蛋白的降解沒有影響。相反，在加入放線菌素D（CHD）以阻斷轉(zhuǎn)錄后的定量實時PCR分析揭示了在lnc-RI敲低細(xì)胞中RAD51 mRNA的快速降解。這些數(shù)據(jù)表明lnc-RI對于穩(wěn)定RAD51 mRNA是必需的。

    miRNA結(jié)合靶mRNA分子的3’UTR區(qū)域以促進(jìn)其降解。據(jù)報道，LncRNA可以競爭性地結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。抑制lnc-RI促進(jìn)RAD51 mRNA的降解。此外，RAD51 mRNA的敲低也抑制了lnc-RI表達(dá)，表明lnc-RI可通過競爭性結(jié)合某些miRNA來調(diào)節(jié)RAD51 mRNA的穩(wěn)定性。

通過搜索開放數(shù)據(jù)庫RegRNA2.0，Tar-getScan，miRDB，miRTarBase，starBase v2.0和microRNA.org-靶標(biāo)和表達(dá)，五種候選miRNA（miR-328，miR-193a-3p，miR-193b-3p，miR-34c-5p和miR-449a）靶向RAD51 mRNA 3’UTR序列和lnc-RI，所有這些都已報道影響腫瘤致癌作用或DDR。

    分別用5種候選miRNA的模擬物轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并通過實時PCR或Western印跡分析檢測lnc-RI和RAD51的表達(dá)。所有五種miRNA模擬物均抑制RNA水平的lnc-RI和RAD51的表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p和miR-34c-5p介導(dǎo)RAD51蛋白表達(dá)的最顯著抑制。這些結(jié)果暗示miR-193a-3p和miR-34c-5p可能是miR-NAs，lnc-RI通過其調(diào)節(jié)RAD51 mRNA的穩(wěn)定性。

    為了確認(rèn)miRNA（miR-193a-3p和miR-34c-5p）的直接相互作用，含有miR-193a-3p或miR-34c-5p結(jié)合位點的RAD51 mRNA的lnc-RI或3’UTR區(qū)域的序列是分別克隆到pGL3M質(zhì)粒的熒光素酶基因的下游。然后用這些報告質(zhì)粒和miR-193a-3p或miR-34c-5p共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。雖然miR-193a-3p顯著抑制兩種候選靶序列的熒光素酶活性，但miR-34c-5p對任一候選靶序列均無影響。因此，我們在進(jìn)一步的研究中關(guān)注miR-193a-3p。

    在用構(gòu)建的質(zhì)粒和miR-193a-3p模擬物（或陰性對照模擬物）共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后48小時的相對熒光素酶活性的分析揭示miR-193a-3p結(jié)合位點的突變減弱。在用lnc-RI-wt和RAD51 3’UTR-wt構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，由miR-193a-3p介導(dǎo)的兩種候選靶序列的熒光素酶活性的抑制。然而，RAD51 mRNA 3’UTR 704-724 bp突變體并未完全緩解miR-193a-3p對RAD51 3’UTR相關(guān)熒光素酶活性的抑制作用，表明RAD51 mRNA 3’UTR序列中可能存在其他miR-193a-3p靶位點。這些結(jié)果表明miR-193a-3p通過直接相互作用調(diào)節(jié)lnc-RI和RAD51的表達(dá)。 

    在本研究中，內(nèi)源性lncRNA lnc-RI表達(dá)與自發(fā)微核率之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，并且lnc-RI的敲除顯示出顯著增加多種細(xì)胞類型中的DSB積累。我們揭示了lnc-RI在DSB修復(fù)的HR途徑中起作用，盡管通過與miR-193a-3p競爭結(jié)合3'UTR區(qū)域來調(diào)節(jié)RAD51 mRNA穩(wěn)定化。Lnc-RI作為ceRNA起作用以減輕miR-193a-3p對RAD51表達(dá)的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為支持lnc-RI在維持基因組穩(wěn)定性中的關(guān)鍵作用提供了有力的證據(jù)。

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