LncRNA MT1DP Aggravates Cadmium-Induced Oxidative Stress by Repressing the Function of Nrf2 and is Dependent on Interaction with miR-365

LncRNA MT1DP通過抑制Nrf2的功能加重鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并且依賴于與miR-365的相互作用

期刊：Advanced Science；影響因子：12.441

發(fā)表單位：中國科學(xué)院          

    之前介紹了lncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過ceRNA發(fā)揮調(diào)控mRNA的機(jī)制，如“這篇lncRNA ceRNA機(jī)制如何發(fā)到 IF12分的”，“胃癌lncRNA ceRNA機(jī)制研究”，“Cancer Cell: lncARSR通過ceRNA調(diào)控腫瘤耐藥（IF: 22.844）”。那么lncRNA、miRNA、mRNA的關(guān)系就一定是ceRNA的關(guān)系嗎，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MT1DP可以結(jié)合穩(wěn)定miR-365，增強(qiáng)其對靶基因Nrf2的抑制作用。一起來看看文章是怎么研究的吧。     

    盡管已經(jīng)確定了鎘（Cd）誘導(dǎo)的肝毒性，但關(guān)于Cd毒性的機(jī)制并不明確。此外，我們建立了lncRNA MT1DP與核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）之間的橋分子：miR-365。機(jī)制上，在Cd脅迫下MT1DP誘調(diào)控Nrf2水平，通過miR-365的升高引起氧化應(yīng)激，miR-365通過直接結(jié)合其3'UTR來抑制Nrf2水平。與競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）機(jī)制相反，提出了一種新的機(jī)制：MT1DP通過直接結(jié)合穩(wěn)定其RNA來提高miR-365水平。        

    鎘（Cd）被認(rèn)為是環(huán)境中最常見的有毒重金屬之一。在最初的Cd暴露時(shí)，細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)（包括酶促抗氧化劑和其他生存分子）被激活以對抗Cd誘導(dǎo)的損傷。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種重要的抗氧化劑轉(zhuǎn)錄因子也被Cd激活，通過反式激活抗氧化分子，包括血紅素氧合酶-1（HO-1）和超氧化物歧化酶（SOD），通過與抗氧化反應(yīng)元素的結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。然而，與促生存信號相比，關(guān)于細(xì)胞內(nèi)促凋亡信號傳導(dǎo)的知識要少得多。迄今為止，對Cd有反應(yīng)活性的細(xì)胞內(nèi)促凋亡分子以及Cd如何牽連刺激這些促凋亡分子仍然很不清楚。            

    我們最近發(fā)現(xiàn)lncRNA MT1DP是促進(jìn)Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，MT1DP誘導(dǎo)是否受Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激仍然不清楚。為了解決這個(gè)問題，我們確定了各種內(nèi)源性氧化應(yīng)激條件下的MT1DP水平。細(xì)胞內(nèi)ROS氧化應(yīng)力在10和20μm處理6小時(shí)的Cd處理后顯著增加30％以上（p<0.05）。同樣地，相對于未處理的細(xì)胞，在10和20μm的Cd持續(xù)6小時(shí)（p<0.001）處理后，MT1DP的表達(dá)水平增加了20倍以上，這表明Cd與觸發(fā)氧化應(yīng)激和MT1DP誘導(dǎo)之間的密切相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明通過Cd處理的MT1DP誘導(dǎo)至少部分地受到氧化應(yīng)激。

    鑒于具有金屬響應(yīng)元件（MRE）的MT1亞家族成員可被金屬響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1（MTF-1）識別和激活，我們假設(shè)MT1DP也可能是MTF1的下游目標(biāo)。類似于MT1DP，MTF1水平也由Cd處理下的氧化應(yīng)激驅(qū)動(dòng)，因?yàn)?/span>Cd處理增加了MTF1水平。盡管在MTF1敲低細(xì)胞中Cd仍然可以顯著促進(jìn)MT1DP誘導(dǎo)（p<0.001），但MTF1敲低細(xì)胞中MT1DP水平的誘導(dǎo)要比對應(yīng)的亂序?qū)φ占?xì)胞弱得多（降低70％）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明MT1DP是MTF1的下游靶標(biāo)。

    隨后的生物信息學(xué)分析揭示了在MT1DP的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)具有兩個(gè)潛在的MRE的區(qū)域。染色質(zhì)免疫沉淀分析顯示，與正常IgG（p<0.001）和參考區(qū)域相比，MTF1抗體（Ab）極大地富集了具有潛在的MRE（啟動(dòng)子中的-320至-220）的區(qū)域近6倍，（-99至-1在啟動(dòng)子）沒有普通的MRE被用作陰性對照。這些結(jié)果表明MT1DP在Cd處理后通過轉(zhuǎn)錄階段的MRE直接受MTF1調(diào)節(jié)。

    為了理解MT1DP誘導(dǎo)對Cd暴露的生理功能，我們使用shRNA策略將內(nèi)源性MT1DP在HepG2細(xì)胞中敲低~80％。Cd誘導(dǎo)對照細(xì)胞中丙二醛（MDA）的增加，而在MT1DP敲低細(xì)胞中觀察到MDA含量沒有顯著變化。為了證實(shí)MT1DP在調(diào)節(jié)Cd處理下的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)中的作用，還測定了抗氧化指標(biāo)SOD，過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）比率。當(dāng)MT1DP被敲低時(shí)，SOD和CAT活性的降低以及響應(yīng)Cd的GSH/GSSG比率均顯著逆轉(zhuǎn)（p<0.05），表明MT1DP是一種新型調(diào)節(jié)劑Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。在MT1DP敲低細(xì)胞中Cd誘導(dǎo)的劑量依賴性ROS產(chǎn)生也顯著減弱（p<0.05），表明MT1DP在響應(yīng)Cd時(shí)引起氧化應(yīng)激的重要作用。

    接下來，我們試圖描繪MT1DP依賴性ROS促進(jìn)的分子基礎(chǔ)。作為主要調(diào)節(jié)因子，Nrf2通過多種機(jī)制起到抵抗氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞損傷的作用，包括通過誘導(dǎo)抗氧化成分（如HO-1和SOD1）去除自由基。特別是，Nrf2已經(jīng)顯示出對Cd誘導(dǎo)的肝毒性起關(guān)鍵作用。在這里，我們努力闡明MT1DP對Nrf2的潛在調(diào)節(jié)作用。與先前的研究一致，Cd處理顯著增加HepG2細(xì)胞中的Nrf2濃度。在添加Cd時(shí)，這種濃度增加可能在具有Nrf2敲低的細(xì)胞中受到嚴(yán)重?fù)p害。與先前的研究結(jié)果一致，與對照細(xì)胞相比，Nrf2敲低使Cd誘導(dǎo)的劑量依賴性ROS產(chǎn)生增加了15-18％，這突出了Nrf2在對抗Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的重要作用。

    為了確定Nrf2和MT1DP之間的聯(lián)系，我們接下來研究了MT1DP和Nrf2相互敲低后的變化。Nrf2敲低對MT1DP的表達(dá)沒有顯著影響。然而，隨著MT1DP的減少，Cd誘導(dǎo)的Nrf2積累可以在細(xì)胞中增強(qiáng)。同時(shí)，在具有MT1DP過表達(dá)的細(xì)胞中，Cd對Nrf2的誘導(dǎo)顯著逆轉(zhuǎn)。因此，這些觀察揭示了MT1DP對Nrf2的調(diào)節(jié)，特別是在Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下。

    為了解釋MT1DP如何調(diào)節(jié)Nrf2水平的機(jī)制，我們搜索了可以結(jié)合MT1DP和Nrf2的伴侶分子。MT1DP和Nrf2 3'UTR在miR-365上共享共有結(jié)合位點(diǎn)，提示這三種RNA分子之間的調(diào)節(jié)機(jī)制。為了進(jìn)一步研究，我們將Nrf2mRNA的3'UTR克隆到熒光素酶報(bào)告基因中，以測試miR-365對Nrf2表達(dá)的影響。應(yīng)用miR-365模擬物后，pGL3-Nrf2-3'UTR的相對熒光素酶活性顯著下降90％（p<0.05）。然而，當(dāng)Nrf2的3'UTR內(nèi)miR-365的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，miR-365對Nrf2-3'UTR活性的抑制作用也顯著受損。類似地，miR-365模擬物也有效抑制Cd誘導(dǎo)的Nrf2蛋白積累，進(jìn)一步證實(shí)即使在Cd處理下Nrf2也直接被miR-365調(diào)節(jié)。

    有趣的是澄清MT1DP如何調(diào)節(jié)miR-365以使后者對Nrf2起作用。為了回答這個(gè)問題，我們調(diào)查了MT1DP對miR-365的調(diào)節(jié)。與亂序?qū)φ占?xì)胞相比，MT1DP shRNA細(xì)胞中MT1DP敲低后miR-365水平顯著降低了50％（p<0.05）。相比之下，MT1DP過表達(dá)細(xì)胞中miR-365水平相對于載體對照細(xì)胞中的水平增加了150％（p<0.05）。值得注意的是，miR-365模擬物對MT1DP的水平?jīng)]有顯著影響，排除了miR-365和MT1DP之間的相互調(diào)節(jié)。

    為了理解MT1DP對miR-365水平的調(diào)節(jié)活性的潛在機(jī)制，通過使用MS2發(fā)夾標(biāo)記的MT1DP進(jìn)行RNA-pull down測定以闡明MT1DP是否可以直接結(jié)合miR-365。與MS2-載體對照細(xì)胞中相比，miR-365在MS2-MT1DP pull down細(xì)胞裂解物中更高度富集（p<0.05），指向兩者間具有直接相互作用。此外，MT1DP缺乏對pri-miR-365的表達(dá)沒有影響，表明MT1DP在轉(zhuǎn)錄水平上不調(diào)節(jié)miR-365。為了進(jìn)一步理解控制MT1DP對miR-365的分子基礎(chǔ)，miR-365是一種DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的抑制劑，用放線菌素/放線菌素D（ActD）來阻斷miR-365的轉(zhuǎn)錄。在用ActD處理后，miR-365的內(nèi)源表達(dá)水平在6-12小時(shí)內(nèi)逐漸下降（p<0.05）;然而，在ActD處理的細(xì)胞中MT1DP的過表達(dá)顯著阻斷了miR-365的下降（p<0.05）。相反，在MT1DP敲低后，在ActD處理的細(xì)胞中miR-365的下降速率進(jìn)一步加速?？傊覀兊?/span>數(shù)據(jù)表明MT1DP通過增強(qiáng)miR-365RNA穩(wěn)定性來提高miR-365濃度。       

    MT1DP是屬于MT1亞家族的假基因，特異性存在于人類基因組中。以前的研究表明MT1DP通過調(diào)節(jié)YAP和Runx2作為腫瘤抑制因子促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。然而，MT1DP的生物學(xué)功能仍然很大程度上未知。本研究的一項(xiàng)主要發(fā)現(xiàn)是通過橋分子miR-365闡明MT1DP與Nrf2之間的聯(lián)系。Nrf2是一種主要的調(diào)節(jié)因子，可以驅(qū)動(dòng)許多抗氧化劑和解毒酶的表達(dá)。Nrf2蛋白質(zhì)誘導(dǎo)是對Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，去除細(xì)胞內(nèi)ROS，因此，由于抗氧化劑和解毒酶水平不足，Nrf2缺乏會(huì)顯著增強(qiáng)氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞損傷。我們的研究結(jié)果顯示，Cd誘導(dǎo)的MT1DP負(fù)調(diào)節(jié)Nrf2濃度以引起氧化應(yīng)激，重要的是，我們定義了MT1DP的下游中間體miR-365，其作用是抑制Nrf2水平。

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