Functional Role of A Novel Long Noncoding RNA TTN-AS1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Progression and Metastasis

新型長非編碼RNA TTN-AS1在食管鱗狀細胞癌進展和轉(zhuǎn)移中的功能作用

期刊：Clinical Cancer Research；影響因子：10.199

發(fā)表單位：中國藥科大學   

    芯片篩選食管癌組織mRNA, lncRNA, miRNA，研究lncRNA ceRNA機制。發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TTN-AS1通過競爭性結(jié)合miR-133b促進轉(zhuǎn)錄因子Snail1的表達，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。

    實驗設計：為了發(fā)現(xiàn)RNAs彼此聯(lián)系的新調(diào)節(jié)通路，使用多個微陣列和多種生物信息學平臺分析來自ESCC和癌旁樣本的lncRNA-miRNA-mRNA的轉(zhuǎn)錄組。通過體內(nèi)和體外獲得和喪失功能測定進一步研究新lncRNA-TTN-AS1的功能作用和機制。由lncRNA-TTN-AS1，miR-133b和FSCN1組成的ESCC生物標志物組通過qRT-PCR和使用來自148名患者的樣品的原位雜交驗證。

    結(jié)果：LncRNA-TN-AS1作為致癌基因，在ESCC組織和細胞系中高表達，促進ESCC細胞增殖和轉(zhuǎn)移。在機理上，lncRNA-TTN-AS1通過競爭性結(jié)合miR-133b促進轉(zhuǎn)錄因子Snail1的表達，導致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）級聯(lián)。此外，lncRNA-TTN-AS1還通過海綿狀miR-133b和mRNA穩(wěn)定蛋白HuR的上調(diào)誘導FSCN1表達，這進一步促進ESCC侵襲級聯(lián)反應。我們還發(fā)現(xiàn)并驗證了臨床適用的ESCC生物標志物組，其由lncRNA-TTN-AS1，miR-133b和FSCN1組成，其與總體存活顯著相關并為ESCC患者提供額外的預后證據(jù)。

    食管癌在世界范圍內(nèi)腫瘤相關性死亡疾病中排名第六位。盡管多模式療法改善了EC的治療和預后，但總的5年生存率仍然很差。隨著高通量分析的進步，已經(jīng)鑒定出與腫瘤增加相關的非編碼RNA。特別地，已經(jīng)證實多種與EC相關的lncRNA通過各種生物過程發(fā)揮多種功能。例如，HNF1A-AS1誘導H19表達并調(diào)節(jié)染色質(zhì)和核小體組裝，導致基因印記。HOX轉(zhuǎn)錄物反義RNA（HOTAIR）通過在啟動子區(qū)誘導組蛋白H3K27甲基化來抑制WIF-1的表達。已發(fā)現(xiàn)許多與EC相關的lncRNA，但ESCC中大多數(shù)lncRNA的精確分子機制仍未完全了解。

    為了理解RNA可以相互串聯(lián)的調(diào)節(jié)通路，通過多個微陣列檢測來自7個ESCC患者（補充表S1）的ESCC組織和癌旁組織中的lncRNA，mRNA和miRNA的表達譜。數(shù)據(jù)編號GSE97051可獲得。為了驗證我們的微陣列數(shù)據(jù)，通過qRT-PCR檢查了14種具有顯著不同表達的轉(zhuǎn)錄物（補充圖S1）。結(jié)果顯示11個轉(zhuǎn)錄物的水平與微陣列數(shù)據(jù)一致。此外，使用共表達網(wǎng)絡（圖1D）和多種生物信息學工具（圖1E）篩選潛在的lncRNA。最后，具有顯著相關性的miRNA-lncRNA對的數(shù)量縮小至3。微陣列數(shù)據(jù)顯示ENST00000589434在ESCC組織中顯著下調(diào)，并且ENST00000589434和hsa-miR-133b之間的相關性得分最高。因此，我們重點研究了lncRNA-TTN-AS1（ENST00000589434）在ESCC中的作用和機制。

    BLAST搜索沒有發(fā)現(xiàn)同源蛋白質(zhì)序列；lncRNA-TTN-AS1的所有外顯子的PhyloCSF值小于零，并且它們的序列保守性較低，這進一步表明它不可能編碼任何蛋白質(zhì)。在線生物信息學分析（cpc）也證實lncRNA-TTN-AS1沒有編碼能力，即lncRNA-TTN-AS1沒有編碼能力。

    眾所周知，作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）的非編碼RNA與miRNA結(jié)合并保護其靶RNA免受抑制或降解。在人ESCC中發(fā)現(xiàn)的miR-133b的下調(diào)促使我們看到lncRNA-TTN-AS1是否與ESCC組織中的miR-133b呈負相關。如所預期的，在組群1中的ESCC組織中lncRNA-TTN-AS1強烈上調(diào)（P=0.000，補充圖S3A。）。相反，miR-133b表達在ESCC組織中顯著下調(diào)（P=0.000）。此外，與正常食管上皮細胞（HEEC）細胞相比，ESCC細胞系中lncRNA-TTN-AS1表達顯著更高，而miR-133b水平更低。一致地，在ESCC組織中（r=-0.8704，P<0.001，補充圖S3E）和細胞系中（r=-0.8500，P<0.001，補充圖.S3F）lncRNA-TTN-AS1和miR-133b之間存在強烈的負相關。

    接下來，我們進行熒光素酶報告分析和RNA pull-down分析，以測試lncRNA-TTN-AS1和miR-133b之間的直接結(jié)合。數(shù)據(jù)表明lncRNA-TTN-AS1是靶向lncRNA的真正的miR-133b。LncRNA-TTN-AS1主要存在于ESCC細胞系的細胞質(zhì)中，這表明lncRNA-TTN-AS1可通過Ago2依賴性RNAi通路與miR-133b結(jié)合。如所預期的，RIP測定顯示抗-Ago2抗體沉淀的lncRNA-TTN-AS1和miR-133b的水平顯著增加，與IgG相比富集2~3倍。同時，Ago2的內(nèi)源性lncRNA-TTN-AS1下調(diào)特異性地在miR-133b的過表達時富集。這些數(shù)據(jù)證實lncRNA-TTN-AS1以Ago2依賴性方式與細胞質(zhì)中的miR-133b結(jié)合。為了進一步證實lncRNA-TTN-AS1為ceRNA，我們比較了lncRNA-TTN-AS1和miR-133b的豐度。在TE-13細胞中，lncRNA-TTN-AS1（每個細胞約1.45個拷貝）的精確拷貝數(shù)高于miR-133b（每個細胞約0.37個拷貝）。此外，lncRNA-TTN-AS1過表達降低了miR-133b的拷貝數(shù)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明lncRNA-TTN-AS1與作為ceRNA的miR-133b物理相互作用。

    為了剖析lncRNA-TTN-AS1在ESCC進展中的作用，使用ESCC細胞系進行獲得和功能喪失測定。lncRNA-TTN-AS1的異位表達誘導細胞增殖和集落形成，而miR-133b的過表達消除了這種增加。在體內(nèi)測定中，與陰性對照相比，具有lncRNA-TTN-AS1過表達克隆的異種移植物中的腫瘤生長增加，而miR-133b的異位表達消除了lncRNA-TTN-AS1誘導的腫瘤生長。另外，lncRNA-TTN-AS1的過表達增加了增殖（Ki67+）癌細胞的比例。

    為了進一步研究lncRNA-TTN-AS1和miR133b對細胞增殖的影響，進行了凋亡相關的實驗。過表達lncRNA-TTN-AS1的ESCC細胞具有顯著減少的G1群體和顯著增加的S期，并且miR-133b的異位表達逆轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象?？傊?，這些結(jié)果表明lncRNA-TTN-AS1通過失活凋亡相關的信號傳導通路誘導細胞增殖并促進細胞周期進展。

    由于miR-133b靶向Snail1和lncRNA-TTN-AS1與Snail1共享miR-133b反應元件，我們推斷lncRNA-TTN-AS1可誘導EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail1并促進ESCC細胞的侵襲。我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-TTN-AS1顯著增加了Snail1的表達，這可以通過miR-133b的異位表達來消除。此外，雙熒光素酶報告基因分析驗證了lncRNA-TTN-AS1的異位表達，但不是突變體，增加了熒光素酶強度，這可以通過miR-133b的過表達來消除。另外，lncRNA-TTN-AS1與Snail1 mRNA水平正相關。這些數(shù)據(jù)說明lncRNA-TTN-AS1通過競爭性結(jié)合miR-133b調(diào)節(jié)Snail1，這可能進一步促進ESCC轉(zhuǎn)移。

    為了進一步檢查lncRNA-TTN-AS1對ESCC細胞轉(zhuǎn)移和EMT級聯(lián)的影響，進行細胞遷移和侵襲以及傷口愈合測定。lncRNA-TTN-AS1的異位表達促進細胞遷移，細胞侵襲和刮擦閉合率，而miR-133b的過表達減弱了lncRNA-TTN-AS1誘導的細胞轉(zhuǎn)移。同時，lncRNA-TTN-AS1顯著誘導間充質(zhì)標志物N-鈣粘蛋白和波形蛋白，并降低上皮標志物E-鈣粘蛋白和ZO-1的表達，這些表達由miR-133b的異位表達拯救。此外，lncRNA-TTN-AS1消除了由miR-133b誘導的Snail1和EMT的抑制。總之，我們的數(shù)據(jù)證明lncRNA-TTN-AS1通過miR-133b的競爭性結(jié)合在激活EMT中起關鍵作用。

    為了確定lncRNA-TTN-AS1和EMT標志物之間的相關性，我們檢測了具有不同lncRNA-TTN-AS1表達的四種ESCC細胞系中EMT標志物的水平。在lncRNA-TTN-AS1高表達細胞中觀察到高水平的Snail1，N-鈣粘蛋白和波形蛋白以及低水平的E-鈣粘蛋白。一致地，lncRNA-TTN-AS1轉(zhuǎn)錄物與ESCC樣品中的E-鈣粘蛋白mRNA水平負相關。

    為了評估lncRNA-TTN-AS1對體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，然后我們將指定的ESCC細胞靜脈內(nèi)注射到裸鼠中以建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型。lncRNA-TTN-AS1的過表達增強了肝臟和肺的熒光強度，通過miR-133b的異位表達減弱。類似地，肝臟和肺中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞隨著lncRNA-TTN-AS1的異位表達顯著增加，而miR-133b消除了增加。以上所有數(shù)據(jù)證實lncRNA-TTN-AS1促進ESCC轉(zhuǎn)移。

    MiR-133b靶向并調(diào)節(jié)與ESCC細胞轉(zhuǎn)移相關的FSCN1（肌動蛋白結(jié)合蛋白，Fascinhomolog1）表達。由于lncRNA-TTN-AS1與FSCN1具有相同的miR-133b結(jié)合位點，我們質(zhì)疑lncRNA-TTN-AS1是否可以通過miR-133b調(diào)節(jié)FSCN1并進一步增強ESCC細胞中的EMT信號傳導通路。一致地，lncRNA-TTN-AS1的過表達增強了FSCN1水平，而miR-133b的異位表達消除了增加。lncRNA-TTN-AS1的過表達增加了pmirGLO-FSCN1的熒光素酶強度。miR-133b的異位表達克服了這種上調(diào)。

    lncRNA的亞細胞定位決定了其潛在的機制。眾所周知，細胞質(zhì)lncRNA通過與RNA結(jié)合蛋白（RBP）的相互作用來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。由于miR-133b靶向并調(diào)節(jié)HuR mRNA，相反，HuR還抑制miR-133b從linc-MD1釋放。因此，我們推斷lncRNA-TTN-AS1也可通過其海綿活性促進HuR，其進一步誘導FSCN1 mRNA表達和穩(wěn)定性。如所預期的，首先，miR-133b的異位表達降低了HuR水平，相反，HuR的消耗增加了TE13細胞中的miR-133b水平。

    為了研究lncRNA-TTN-AS1/miR-133b/FSCN1水平與ESCC進展之間的關聯(lián)，我們通過qRT-PCR和原位測量了組1和組2中lncRNA-TTN-AS1/miR-133b/FSCN1的表達水平。分別進行雜交（ISH）測定。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，lncRNA-TTN-AS1和FSCN1主要在ESCC組織中表達，而miR-133b在正常組織中表達更豐富。

    Kaplan-Meier和對數(shù)秩檢驗分析證實，lncRNA-TTN-AS1/FSCN1高表達或miR-133b低表達的患者與總生存期降低（OS）呈正相關。此外，具有lncRNA-TTN-AS1-high/miR-133b-low的ESCC患者的總體存活率短于其他三組中的患者。

    我們的研究表明，lncRNA-TTN-AS1促進ESCC細胞增殖和侵襲-轉(zhuǎn)移，誘導與miR-133b的競爭性結(jié)合，導致Snail1，HuR和FSCN1的上調(diào)。此外，由lncRNA-TTN-AS1誘導的HuR增加β-連環(huán)蛋白表達，通過與HuR的相互作用增強FSCN1mRNA表達和穩(wěn)定性。lncRNA-TTN-AS1對ESCC進展的多效性為我們對ESCC癌變的理解提供了重要的新見解。

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