期刊：NEURO-ONCOLOGY；影響因子：9.384

發(fā)表單位：南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 

    許多l(xiāng)ncRNA是miRNA的宿主基因，TCGA等數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)許多miRNA宿主lnc顯著差異表達(dá)，生存曲線顯著，那么這類lnc一般怎么研究呢，之前我們介紹過“宿主lncRNA與miRNA是否有關(guān)系呢？”，“腫瘤耐藥中l(wèi)ncRNA, miRNA是怎么發(fā)揮作用的呢”，本研究同樣選擇lncRNA及其衍生的miRNA的關(guān)系進(jìn)行研究，通過數(shù)據(jù)庫資源挖掘找到MIR155HG，發(fā)現(xiàn)其衍生的miR-155抑制protocadherin9和protocadherin7表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

    背景：MIR155宿主基因（MIR155HG）是一種長鏈非編碼RNA，被認(rèn)為是miR-155的主要miRNA。MIR155HG在造血，炎癥和腫瘤發(fā)生中起重要作用。我們的研究調(diào)查了MIR155HG/miR-155軸在膠質(zhì)瘤中的臨床意義，生物學(xué)功能，機(jī)制和小分子抑制劑。

    結(jié)果：MIR155HG高表達(dá)與膠質(zhì)瘤分級，間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和預(yù)后不良有關(guān)。在功能上，通過抑制其衍生物miR-155-5p和miR-155-3p的產(chǎn)生，通過小干擾RNA減少MIR155HG抑制細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和原位神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長。生物信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告分析顯示，protocadherin9和protocadherin7分別是miR-155-5p和miR-155-3p的直接靶標(biāo)，后者通過抑制Wnt/β-catenin通路起腫瘤抑制因子的作用。最后，我們將NSC141562鑒定為MIR155HG/miR-155軸的有效小分子抑制劑。

    長鏈非編碼RNA（lncRNA）是非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，長度超過200個(gè)核苷酸，在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的分子作用，包括染色質(zhì)重塑，轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。LncRNA普遍涉及不同的生理和病理過程，如印記，免疫反應(yīng)，癌癥進(jìn)展和細(xì)胞凋亡控制。

    上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的過程，并且越來越多的研究揭示了它與膠質(zhì)瘤的發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)系。由于膠質(zhì)瘤不是上皮來源，我們更喜歡稱之為間充質(zhì)轉(zhuǎn)變。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)MIR155HG/miR-155軸與膠質(zhì)分級，間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和預(yù)后不良密切相關(guān)，并鑒定了NSC141562，一種有效的小分子抑制劑MIR155HG/miR-155軸。因此，MIR155HG/miR-155軸的致癌功能可以作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的潛在靶標(biāo)。

    為了檢測人腦膠質(zhì)瘤中MIR155HG的表達(dá)，我們最初分析了CGGA數(shù)據(jù)集中5個(gè)正常組織和220個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的全基因組基因譜。如圖1A所示，與正常組織相比，GBM組織顯示MIR155HG轉(zhuǎn)錄水平顯著增加（P=.0051）。此外，MIR155HG在高分化膠質(zhì)瘤（HGG）中的表達(dá)顯著高于低分化膠質(zhì)瘤（LGG）。我們接下來檢查了另一個(gè)獨(dú)立的膠質(zhì)瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)集REMBRANDT中MIR155HG表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤分級之間的關(guān)聯(lián)。我們發(fā)現(xiàn)MIR155HG與腫瘤分級顯著相關(guān)，這與CGGA數(shù)據(jù)一致。這些發(fā)現(xiàn)共同表明MIR155HG可能在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用（注意：作者使用CGGA、REMBRANDT兩個(gè)數(shù)據(jù)庫資源分析到MIR155HG顯著差異表達(dá)）。

    為了研究MIR155HG表達(dá)與總體存活之間的相關(guān)性，我們在CGGA和REMBRANDT數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了對數(shù)秩比較的Kaplan-Meier生存曲線分析。我們發(fā)現(xiàn)MIR155HG的高表達(dá)與總體存活率呈負(fù)相關(guān)（P=.0196，圖1B）。在REMBRANDT數(shù)據(jù)中檢測到類似的結(jié)果（P=.0065）。這些數(shù)據(jù)表明MIR155HG的過表達(dá)賦予GBM患者預(yù)后不良。

    然后，我們進(jìn)行了多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以評估有助于總體生存的因素。MIR155HG表達(dá)，KPS評分和增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)與總生存率無關(guān)，當(dāng)考慮年齡，切除，表皮生長因子受體，Ki-67，拓?fù)洚悩?gòu)酶II型和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶pi，這些結(jié)果一起暗示MIR155HG可以作為GBM患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

    使用來自CGGA數(shù)據(jù)集的表達(dá)數(shù)據(jù)，我們在高MIR155HG表達(dá)組中鑒定了1858個(gè)上調(diào)基因和2120個(gè)下調(diào)基因（注意：一個(gè)很巧妙的處理方式，如果腫瘤樣品比較多，將腫瘤組織依據(jù)該基因分成高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行差異比較分析，不就相當(dāng)于做了過表達(dá)/敲低實(shí)驗(yàn)嗎）。我們將這些基因命名為“MIR155HG差異表達(dá)基因”。我們進(jìn)行了GSEA以驗(yàn)證我們是否能夠檢測CG在CGGA數(shù)據(jù)中列出的間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的差異，我們發(fā)現(xiàn)與LGG相比這些基因確實(shí)在HGG中顯著富集。此外，MIR155HG差異表達(dá)基因的GSEA在GBM的高MIR155HG表達(dá)樣品中顯示出間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的顯著富集。

    然后進(jìn)行GSEA以鑒定基因GO富集、KEGG通路富集，這些通路由高MIR155HG表達(dá)組和低表達(dá)組之間的MIR155HG差異表達(dá)基因差異調(diào)節(jié)。GSEA結(jié)果揭示了許多間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)類別（細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外區(qū)域，細(xì)胞遷移，對創(chuàng)傷的反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和粘著斑）。此外，GSEA表明6種不同的已發(fā)表的間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)基因信號通路在高MIR155HG表達(dá)樣本中顯著富集，強(qiáng)烈表明MIR155HG誘導(dǎo)了普遍和持續(xù)的間充質(zhì)轉(zhuǎn)換信號程序（注意：機(jī)制研究通常要關(guān)聯(lián)通路，如果有基因表達(dá)譜，通過GSEA、GO、KEGG富集等方法可關(guān)聯(lián)到通路）。

    來自患者的10個(gè)NBT和10個(gè)原發(fā)GBM樣品用于通過RT-PCR檢測MIR155HG的表達(dá)狀態(tài)。如圖1E所示，與NBT水平相比，這些GBM標(biāo)本中MIR155HG的水平顯著上調(diào)（P<.0001）。我們從Cheng的列表中選擇了3個(gè)間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)標(biāo)記（POSTN，MMP11和FN1），發(fā)現(xiàn)具有高MIR155HG表達(dá)（n = 5）的GBM中的表達(dá)水平高于具有低MIR155HG表達(dá)的那些（n = 5）（圖1F）。接下來，為了直接測試MIR155HG在間充質(zhì)轉(zhuǎn)換中的功能作用，MIR155HG被神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的特異性siRNA下調(diào)。MIR155HG減少引起β-連環(huán)蛋白，N-鈣粘蛋白，波形蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9的顯著降低（圖1G）。這些結(jié)果強(qiáng)烈證明MIR155HG是間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)的lncRNA（注意：lncRNA影響了哪個(gè)通路？LncRNA的表達(dá)量變化顯著改變了某個(gè)通路的基因尤其是重要基因，他就改變了哪個(gè)通路）。

    與NC細(xì)胞相比，用siMIR155HG轉(zhuǎn)染后，U87，U251和原代GBM細(xì)胞中的細(xì)胞增殖被顯著抑制。與NC相比，用siMIR155HG轉(zhuǎn)染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞顯著減少了劃痕傷口愈合和較低的侵襲能力。為了進(jìn)一步檢查腫瘤生長是否被siMIR155HG抑制，我們在體內(nèi)使用U87原位膠質(zhì)瘤模型進(jìn)行分析。在Lenti-NC和Lenti-siMIR155HG處理組之間檢測到生物發(fā)光成像所顯示的腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。此外，用Lenti-siMIR155HG治療與小鼠的存活時(shí)間顯著延長相關(guān)。

    MIR155HG是miR-155的主要miRNA，因此我們接下來檢查miR-155表達(dá)。MIR155HG敲低顯著降低了U87和原代GBM細(xì)胞中miR-155-5p和miR-155-3p的表達(dá)。Pearson相關(guān)性分析顯示在158個(gè)膠質(zhì)瘤和64個(gè)GBM組織中MIR155HG和miR-155-5p或miR-155-3p之間顯著且正相關(guān)。單因素方差分析顯示，miR-155-5p和miR-155-3p均與腫瘤分級顯著相關(guān)，且GBM中的表達(dá)水平高于LGG。此外，miR-155-3p的高表達(dá)與GBM患者的較差存活結(jié)果相關(guān)（P=.0448），而miR-155-5p表達(dá)與總體存活無顯著相關(guān)性。miR-155-5p或miR-155-3p的表達(dá)分別被抗miR-155-5p或抗miR-155-3p轉(zhuǎn)染下調(diào)，細(xì)胞增殖，遷移，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著抑制和侵襲。

    為了確定與MIR155HG相關(guān)的表型是否由miR-155-5p和miR-155-3p介導(dǎo)，我們用miR-155-5p或miR-155-3p模擬物共轉(zhuǎn)染siMIR155HG。miR-155-5p或miR-155-3p的過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了siMIR155HG誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的抑制?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明miR-155-5p和miR-155-3p是MIR155HG在膠質(zhì)瘤中生物學(xué)功能的重要參與者。

    為了探索miR-155-5p和miR-155-3p的下游靶標(biāo)，我們使用2種在線算法TargetScan和microRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以預(yù)測mRNA靶標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)PCDH9在其3'非翻譯區(qū)（UTR）中含有miR-155-5p的推定結(jié)合位點(diǎn)，PCDH7含有miR-155-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)。CGGA數(shù)據(jù)顯示miR-155-5p和PCDH9之間以及miR-155-3p和PCDH7之間顯著負(fù)相關(guān)。此外，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-155-5p或miR-155-3p表達(dá)降低導(dǎo)致PCDH9或PCDH7蛋白增加。熒光素酶報(bào)告基因測定顯示，miR-155-5p的過表達(dá)導(dǎo)致PCDH9-3'UTR野生型構(gòu)建體在U87細(xì)胞中的熒光素酶活性顯著降低，而PCDH9-3'UTR突變體的熒光素酶活性沒有變化，其含有推定的結(jié)合位點(diǎn)的突變。用miR-155-3p觀察到類似的數(shù)據(jù)。我們的結(jié)果強(qiáng)烈表明PCDH9和PCDH7分別是miR-155-5p和miR-155-3p的直接靶標(biāo)（注意：尋找miRNA的靶基因，1）先用軟件如TargetScan預(yù)測，2）qPCR確定miRNA與靶基因是否是負(fù)相關(guān)，3）而后熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，4）靶基因過表達(dá)敲低實(shí)驗(yàn)證明其在腫瘤進(jìn)展中的作用）。

    為了測試PCDH9和PCDH7是否介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-155的生物學(xué)功能，PCDH9和PCDH7表達(dá)載體用于營救實(shí)驗(yàn)。通過蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證PCDH9和PCDH7的過表達(dá)。PCDH9和PCDH7的過表達(dá)抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。這些結(jié)果與miR-155減少的效果一致（注意：此處PCDH9和PCDH7過表達(dá)證明兩個(gè)基因在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用）。此外，當(dāng)細(xì)胞與miR-155-5p和PCDH9，或miR-155-3p和PCDH7共轉(zhuǎn)染時(shí)，miR-155在促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲方面的作用顯著減弱。這些結(jié)果進(jìn)一步表明PCDH9和PCDH7是miR-155的功能性下游靶標(biāo)。

    為了研究潛在的機(jī)制，我們對潛在的中介因子進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果顯示PCDH9和PCDH7的過表達(dá)顯著下調(diào)β-catenin和cyclinD1的表達(dá)，并增加磷酸化β-catenin的水平（pβ-連環(huán)蛋白）。此外，同時(shí)過表達(dá)miR-155-5p / -3p和PCDH9 / 7消除了miR-155-5p / -3p引起的β-catenin下調(diào)和β-catenin及cyclin D1的上調(diào)?？傊?，這些數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)，即作為miR-155直接靶標(biāo)的PCDH9和PCDH7通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路起到腫瘤抑制基因的作用（注意：PCDH9和PCDH7過表達(dá)顯著抑制Wnt/β-catenin通路中重要的蛋白β-catenin和cyclinD1下調(diào)，從而關(guān)聯(lián)到Wnt/β-catenin）。

    MIR155HG已被定性為涉及多種生理和病理過程的重要調(diào)節(jié)因子，如造血，炎癥，免疫和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在我們的研究中，MIR155HG與腫瘤分級呈正相關(guān)，并且代表了GBM患者的獨(dú)立不良預(yù)后因素。MIR155HG抑制在體外和體內(nèi)抑制膠質(zhì)瘤生長。GSEA和體外實(shí)驗(yàn)證明MIR155HG調(diào)節(jié)間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

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