Long noncoding RNA OCC-1 suppresses cell growth through destabilizing HuR protein in colorectal cancer

長(zhǎng)非編碼RNA OCC-1通過使結(jié)腸直腸癌中的HuR蛋白去穩(wěn)定來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

期刊：NUCLEIC ACIDS RESEARCH；影響因子：11.561

發(fā)表單位：四川大學(xué)   

    lncRNA可以通過序列互補(bǔ)的方式結(jié)合miRNA發(fā)揮ceRNA作用促進(jìn)靶基因表達(dá)。這方面我們解讀了大量文獻(xiàn)，具體可查看“lncRNA ceRNA機(jī)制研究繼續(xù)”。lncRNA也可與蛋白質(zhì)直接結(jié)合影響蛋白質(zhì)的修飾過程如磷酸化、泛素化等，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的狀態(tài)進(jìn)而影響后續(xù)靶標(biāo)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程。本研究通過數(shù)據(jù)庫挖掘到OCC-1在結(jié)直腸癌中很重要（如何挖掘數(shù)據(jù)庫：TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA數(shù)據(jù)挖掘），選擇lnc結(jié)合蛋白角度研究其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)OCC-1與HuR結(jié)合，增強(qiáng)了E3連接酶β-TrCP1與HuR的結(jié)合，并使HuR易于泛素化和降解，而HuR的靶基因是一系列的癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的基因。從而發(fā)現(xiàn)OCC-1通過此機(jī)制抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

    OCC-1是結(jié)腸直腸癌（CRC）中最早注釋的長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）之一；然而，它的功能仍然很大程度上未知，在這個(gè)研究中我們發(fā)現(xiàn)OCC-1在CRC中起著腫瘤抑制作用。通過RNA干擾的OCC-1敲低促進(jìn)體外和體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，OCC-1的過表達(dá)可以抑制OCC-1敲低細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)。OCC-1通過與HuR戴白結(jié)合并使其不穩(wěn)定來發(fā)揮其功能，該蛋白可以結(jié)合并穩(wěn)定數(shù)千種mRNA。OCC-1增強(qiáng)泛素E3連接酶β-TrCP1與HuR的結(jié)合，并使HuR易于泛素化和降解，從而降低HuR及其靶mRNA的水平，包括與癌細(xì)胞生長(zhǎng)直接相關(guān)的mRNA。

    長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）是一類具有有限蛋白質(zhì)編碼潛力的大轉(zhuǎn)錄物。LncRNAs作為染色質(zhì)修飾復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用支架，蛋白質(zhì)誘餌，miRNA海綿等，在基因調(diào)控的多個(gè)步驟中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

    為了研究OCC-1在CRC中的臨床相關(guān)性，我們首先使用來自TCGA數(shù)據(jù)分析OCC-1表達(dá)。結(jié)果顯示，與原位癌（Tis）和I期腫瘤（P=0.04，圖1A，左）相比，具有晚期T期（II期至IV期）的樣品中OCC-1表達(dá)顯著下調(diào)。我們還使用GEO微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE39582）分析了OCC-1表達(dá)。一致地，在晚期T期腫瘤中OCC-1的水平顯著較低（P=0.02，圖1A，右）。這些結(jié)果表明OCC-1與CRC的早期發(fā)展有關(guān)。（注意：使用數(shù)據(jù)庫資源尋找重要的lncRNA）。

    我們首先通過RT-qPCR評(píng)估六種常見CRC細(xì)胞系中OCC-1 RNA的豐度。結(jié)果顯示在這些CRC細(xì)胞中OCC-1 RNA豐富。此外，OCC-1主要定位于Caco-2和HCT116細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，如通過亞細(xì)胞組分分析和RNAscope FISH實(shí)驗(yàn)所揭示的（圖1B）。為了研究OCC-1功能，我們使用兩種獨(dú)立的短發(fā)夾RNA（shRNA，shOCC-1-1和-2）通過RNA干擾敲低OCC-1。結(jié)果顯示，OCC-1敲低顯著增加Caco-2和HCT116細(xì)胞中的細(xì)胞增殖（圖1D）。Ki67染色也證實(shí)了增殖的增加，因?yàn)樵贠CC-1敲低細(xì)胞中Ki67陽性增殖細(xì)胞的比例顯著更高（圖1E）。OCC-1敲低細(xì)胞比其對(duì)照細(xì)胞形成更多的集落（圖1G），這進(jìn)一步證實(shí)了OCC-1在細(xì)胞生長(zhǎng)中的抑制作用。此外，進(jìn)行Transwell測(cè)定以測(cè)試OCC-1對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響。然而，在Caco-2和HCT1116細(xì)胞中OCC-1敲低時(shí)未觀察到細(xì)胞遷移和侵襲能力的顯著變化?？傊?，這些結(jié)果表明OCC-1抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。（注意：使用細(xì)胞系敲低lnc，驗(yàn)證該lnc對(duì)細(xì)胞增殖，遷移，侵襲的影響）。

    為了測(cè)試OCC-1對(duì)體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，我們通過將OCC-1敲低和對(duì)照細(xì)胞皮下注射到裸鼠的右側(cè)腹部進(jìn)行腫瘤發(fā)生測(cè)定。結(jié)果顯示OCC-1敲低可加速腫瘤生長(zhǎng)。此外，通過Ki67染色確定，OCC-1敲低細(xì)胞腫瘤中細(xì)胞活力也增加。這些結(jié)果表明OCC-1也促進(jìn)了體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)。（注意：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明lnc敲低促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)）。

    為了深入了解OCC-1的分子功能，我們通過微陣列分析了OCC-1敲低后Caco-2細(xì)胞的基因表達(dá)。兩個(gè)獨(dú)立的shRNA，shOCC-1-1和-2，對(duì)基因表達(dá)譜表現(xiàn)出相似的效果，?68％和?73％的差異表達(dá)基因（DEG）相互重疊（圖4A）?？偟膩碚f，592個(gè)基因的表達(dá)被兩種shRNA破壞，并且大多數(shù)（93％，554/592）上調(diào)，而只有38個(gè)基因下調(diào)（圖4B）。OCC-1抑制基因的GO富集分析揭示OCC-1主要抑制在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平起作用的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，特別是與RNA剪接和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的調(diào)節(jié)因子（圖4C）。我們選擇了幾種已被報(bào)道參與癌癥進(jìn)展的OCC-1抑制基因，并通過RT-qPCR驗(yàn)證了它們的表達(dá)。與微陣列分析一致，結(jié)果證實(shí)在OCC-1敲低后這些選擇的基因的水平均適度增加（圖4D）。因此，我們認(rèn)為這些細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因的上調(diào)直接導(dǎo)致在OCC-1敲低細(xì)胞中觀察到的增加的細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)（注意：為了尋找lnc調(diào)控分子機(jī)制，作者敲低OCC-1，分析基因的表達(dá)譜變化，可以很好了解該lnc調(diào)控哪些基因，通路，發(fā)現(xiàn)RNA剪接和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的調(diào)節(jié)因子顯著變化，也就是lnc的靶基因。但這個(gè)方法依然不能知道lnc具體是跟哪個(gè)蛋白結(jié)合的）。

    為了探索OCC-1在基因表達(dá)調(diào)控中的非編碼功能，我們使用OCC-1 3'UTR作為RNA探針進(jìn)行RNApull-down測(cè)定，以鑒定其蛋白質(zhì)配偶體。此外，通過RIP實(shí)驗(yàn)也在Caco-2細(xì)胞中證實(shí)了HuR和OCC-1之間的關(guān)聯(lián)。在最近使用PAR-CLIP（可光活化的核糖核苷增強(qiáng)交聯(lián)和免疫沉淀）繪制HuR結(jié)合位點(diǎn)的研究中，還發(fā)現(xiàn)OCC-1與HuR相互作用，所有四個(gè)CLIP HuR結(jié)合位點(diǎn)定位于其3'UTR中。（注意：作者打算從lnc可以結(jié)合蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的角度闡釋該lnc的功能，采用RNA pull-down實(shí)驗(yàn)釣取lnc結(jié)合蛋白）。

    CLIP研究還定義了一組HuR共有靶mRNA。與通過我們的微陣列分析檢測(cè)到的OCC-1抑制基因類似，這些HuR靶標(biāo)中的大多數(shù)是在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平起作用的基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的mRNA。實(shí)際上，我們發(fā)現(xiàn)OCC-1抑制基因顯著富集了那組HuR靶標(biāo)，其中約74％（408/554）的OCC-1抑制基因也是HuR靶標(biāo)，包括已經(jīng)選擇用于RT-qPCR驗(yàn)證的所有這六種癌癥相關(guān)基因。因此，我們進(jìn)一步檢查這些mRNA是否通過RIP測(cè)定與Caco-2細(xì)胞中的HuR相互作用。如所預(yù)期的，結(jié)果顯示所有這六種選擇的mRNA均通過HuR RIP顯著富集，表明它們是Caco-2細(xì)胞中的HuR靶mRNA。然后，還通過使用先前驗(yàn)證的shRNA敲低HuR來測(cè)試HuR對(duì)這些mRNA的作用，其導(dǎo)致Caco-2細(xì)胞中HuR mRNA和蛋白質(zhì)水平的顯著降低。在HuR敲低后，這些mRNA的水平均略微但顯著降低。總之，這些結(jié)果表明大多數(shù)OCC-1抑制基因是HuR靶標(biāo)，并且OCC-1可能通過其與HuR蛋白的結(jié)合而下調(diào)這些mRNA。（注意：找到HuR蛋白后呢，繼續(xù)研究HuR功能，通過查文獻(xiàn)及CLIP實(shí)驗(yàn)釣取HuR蛋白結(jié)合的mRNA，從而解釋芯片篩選到lnc抑制的大部分基因是通過HuR抑制的）。

    鑒于OCC-1對(duì)HuR靶mRNA的主要作用，我們推斷OCC-1可通過調(diào)節(jié)HuR蛋白發(fā)揮其功能。因此，我們首先確定了OCC-1敲低對(duì)Caco-2細(xì)胞中HuR mRNA和蛋白質(zhì)水平的影響。與微陣列分析結(jié)果一致，通過RT-qPCR測(cè)定，OCC-1敲低對(duì)HuR mRNA水平?jīng)]有明顯影響；然而，在OCC-1敲低后，HuR蛋白的水平增加。這些結(jié)果表明OCC-1 RNA可以下調(diào)HuR蛋白（注意：既然該lnc與HuR直接相關(guān)作用，作者敲低lnc，qPCR檢測(cè)HuR mRNA表達(dá)量變化，檢測(cè)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)僅蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變，說明lnc影響的是蛋白水平，可能抑制蛋白降解，也可能促進(jìn)蛋白降解，此處二者是負(fù)相關(guān)，促進(jìn)蛋白降解）。

    鑒于HuR蛋白水平受到調(diào)節(jié)，我們認(rèn)為OCC-1可能調(diào)節(jié)HuR蛋白的穩(wěn)定性。因此，我們用環(huán)己酰亞胺（CHX）處理細(xì)胞以抑制蛋白質(zhì)合成并通過蛋白質(zhì)印跡確定剩余HuR的水平。保留在OCC-1敲低細(xì)胞中的HuR部分相對(duì)高于對(duì)照細(xì)胞，表明HuR蛋白在OCC-1敲低后更穩(wěn)定。由于先前已報(bào)道HuR穩(wěn)定性受泛素蛋白-蛋白酶體通路調(diào)節(jié)，我們用特異性蛋白酶體抑制劑MG132處理OCC-1敲低細(xì)胞，以通過蛋白酶體阻斷蛋白質(zhì)的降解。MG132處理導(dǎo)致OCC-1敲低細(xì)胞中HuR的積累達(dá)到與對(duì)照細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃?，這表明HuR是蛋白酶體底物，并且HuR的相對(duì)較高水平未經(jīng)處理的OCC-1敲低細(xì)胞主要是由于HuR降解的減少（注意：促進(jìn)蛋白質(zhì)降解自然聯(lián)想到蛋白質(zhì)泛素化過程）。

    然后我們測(cè)量了在用表達(dá)HA標(biāo)記的泛素蛋白（HA-Ub）的質(zhì)粒和表達(dá)FLAG標(biāo)記的HuR（FLAG-HuR）的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的OCC-1敲低細(xì)胞中HuR的泛素蛋白化。通過HAIP捕獲泛素蛋白化的FLAG-HuR蛋白，并使用抗FLAG抗體通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。在OCC-1敲低細(xì)胞中HuR泛素蛋白化的程度顯著降低，這表明OCC-1在HuR泛素蛋白化過程中具有正調(diào)節(jié)作用。因此，我們進(jìn)一步確定了OCC-1對(duì)HuR與其泛素蛋白E3連接酶β-TrCP1結(jié)合的影響，其靶向HuR進(jìn)行泛素化和降解。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，OCC-1的敲低減弱了HuR和β-TrCP1之間的相互作用。因此，OCC-1可通過增強(qiáng)HuR和E3連接酶β-TrCP1之間的相互作用來促進(jìn)HuR泛素化?？傊?，我們推斷OCC-1通過增強(qiáng)其與泛素E3連接酶β-TrCP1的結(jié)合來促進(jìn)HuR的泛素化和降解。

    LncRNA可具有致癌或腫瘤抑制功能。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OCC-1在CRC中抑制體外和體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)。OCC-1與HuR蛋白結(jié)合并使HuR易于泛素化和降解，從而降低HuR及其靶mRNA的水平，包括與癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的mRNA。我們推斷OCC-1主要通過調(diào)節(jié)HuR蛋白發(fā)揮其功能，因?yàn)榧s74％的OCC-1抑制的mRNA是已知的HuR靶標(biāo)。

    迄今為止，還發(fā)現(xiàn)一些lncRNA調(diào)節(jié)其結(jié)合蛋白的翻譯后修飾。NKILA是抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的lncRNA，與NF-κB/IκB形成穩(wěn)定的復(fù)合物，直接掩蓋IκB的磷酸化基序，從而抑制IκB磷酸化和隨后的NF-κB活化。相反，lnc-DC是人類樹突細(xì)胞分化和功能所需的lncRNA，它阻止轉(zhuǎn)錄因子STAT3被SHP1去磷酸化，SHP1是STAT3的蛋白酪氨酸磷酸酶，后者又維持STAT3活性。在Lnc-DC-STAT3相互作用的情況下，Lnc-DC的結(jié)合減弱了STAT3和磷酸酶SHP1之間的結(jié)合，從而保留了STAT3的磷酸化狀態(tài)。因此，lncRNA的結(jié)合可以影響修飾位點(diǎn)的可用性或翻譯后修飾酶與靶蛋白之間的關(guān)聯(lián)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OCC-1通過增強(qiáng)其與泛素E3連接酶β-TrCP1的結(jié)合來促進(jìn)HuR泛素化，其可以識(shí)別HuR并催化其泛素化。

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