Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression

lncRNA lncKdm2b通過啟動Zfp292表達(dá)來持續(xù)維持ILC3細(xì)胞

期刊：Nat.Immunol.；影響因子：21.809              

發(fā)表單位：中國科學(xué)院                                                           

    LncKdm2b表達(dá)通過激活轉(zhuǎn)錄因子Zfp292促進(jìn)其增殖，從而持續(xù)ILC3的維持。

   在這項研究中，我們觀察到一個不同的長非編碼RNA，lncKdm2b，在腸組3ILCs（ILC3s）中高水平表達(dá)。造血系統(tǒng)中的LncKdm2b缺乏導(dǎo)致ILC3的數(shù)量和效應(yīng)功能的減少。LncKdm2b表達(dá)通過激活轉(zhuǎn)錄因子Zfp292促進(jìn)其增殖，從而持續(xù)ILC3的維持。在機制上，lncKdm2b將染色質(zhì)組織者Satb1和核重構(gòu)因子（NURF）復(fù)合物募集到Zfp292啟動子上以啟動其轉(zhuǎn)錄。敲除Zfp292或Bptf也減弱了ILC3的維持，導(dǎo)致易受細(xì)菌感染。因此，我們的研究結(jié)果表明，lncRNA可能代表ILC發(fā)展和功能的另一層調(diào)節(jié)。

    ILC根據(jù)其特征效應(yīng)細(xì)胞因子可分為三組，類似于CD4⁺輔助T細(xì)胞亞群的分類：ILC1s、ILC2、ILC3s。ILC3與其他ILC一起來源于最早的祖細(xì)胞（α-LP（淋巴祖細(xì)胞）細(xì)胞，表達(dá)整合素α4β7的CXCR+CLPs），其分化成受限制的常見輔助樣先天淋巴祖細(xì)胞（CHILP）。下游常見ILC前體（ILCP）的特征在于轉(zhuǎn)錄因子PLZF的表達(dá)，并且可以產(chǎn)生ILC1，ILC2和ILC3亞組。越來越多的證據(jù)表明ILC3譜系規(guī)范是由命運決定轉(zhuǎn)錄因子控制的。例如，RORγt（由Rorc編碼）驅(qū)動ILC3與其前體ILCP的區(qū)別。Rorc缺失導(dǎo)致ILC3完全喪失，但不會導(dǎo)致ILC1或ILC2缺失。此外，芳烴受體在ILC3中以高水平表達(dá)，并且是維持ILC3所必需的。ILC3的開發(fā)和維護(hù)也需要GATA-3。然而，它調(diào)節(jié)ILC3開發(fā)和/或維護(hù)的潛在機制仍然是難以捉摸的。

    我們鑒定了胚胎干細(xì)胞多能性維持所需的無特征的lncRNA，我們稱之為lncKdm2b。LncKdm2b缺陷導(dǎo)致早期胚胎致死。我們觀察，lncKdm2b在小鼠的固有層淋巴細(xì)胞（LPL）中以高水平組成型表達(dá)。然后，我們檢測淋巴祖細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的lncKdm2b表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ILC3群體中的高lncKdm2b表達(dá)，并通過RNA熒光原位雜交得到證實。我們通過CRISPR-Cas9技術(shù)建立了lncKdm2b^flox/flox小鼠。將lncKdm2b^flox/flox小鼠與Rorc-Cre小鼠雜交以從ILC3s有條件地刪除lncKdm2b來生成lncKdm2b^flox/floxRorc-Cre⁺（以下稱為lncKdm2b^-/-）小鼠。我們觀察到，與lncKdm2b^flox/floxRorc-Cre^-（下文中稱為lncKdm2b^+/+）同窩對照小鼠相比，該lncKdm2b缺失導(dǎo)致所有ILC3亞群的數(shù)量顯著減少。我們通過原位免疫熒光染色驗證了這些觀察結(jié)果，表明lncKdm2b參與ILC3的維持。

    我們觀察到的ILC3數(shù)量減少可能是由細(xì)胞死亡增加和/或細(xì)胞群擴(kuò)大減少引起的。為了評估體內(nèi)ILC3s的周轉(zhuǎn)率，我們給小鼠施用BrdU3天，然后對來自小腸的組織進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以測量攝取。我們注意到來自lncKdm2b^-/-小鼠的ILC3s比同窩對照小鼠的ILC3s吸收的BrdU少得多。我們接下來分離野生型和lncKdm2b缺陷的ILC3，用CFSE標(biāo)記它們，并進(jìn)行體內(nèi)增殖測定。我們觀察到與野生型ILC3相比，lncKdm2b缺陷型ILC3的增殖顯著降低。類似地，lncKdm2b缺陷型ILC3中Ki67⁺細(xì)胞的頻率遠(yuǎn)低于野生型ILC3中的頻率。我們觀察到lncKdm2b過表達(dá)恢復(fù)了lncKdm2b缺乏-受損的增殖。然而，lncKdm2b缺陷小鼠中活性caspase-3⁺ILC3的百分比與野生型小鼠中的百分比相當(dāng)，這表明lncKdm2b缺陷的ILC3不經(jīng)歷凋亡?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)使我們得出結(jié)論，lncKdm2b調(diào)節(jié)ILC3s的增殖，但不調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

    我們用來自小鼠LPL裂解物的生物素標(biāo)記的lncKdm2b進(jìn)行RNA pull-down測定，以鑒定潛在的lncKdm2b相關(guān)蛋白。通過RNApull-down和質(zhì)譜法鑒定Satb1（基因組組織蛋白）在LPL中與lncKdm2b結(jié)合。我們通過RNApull-down和RNA反義純化進(jìn)一步驗證了lncKdm2b與Satb1的相互作用，然后進(jìn)行免疫印跡分析，以及通過RNA免疫沉淀測定。Satb1在LPL中以高水平表達(dá)，而相關(guān)蛋白Satb2不可檢測。此外，通過RNA-FISH測定顯示lncKdm2b與ILC3細(xì)胞核中的Satb1共定位。我們通過結(jié)構(gòu)域作圖鑒定了相互作用位點，發(fā)現(xiàn)lncKdm2b的特異性片段（nt450-700）是結(jié)合Satb1蛋白所必需的。我們通過RNA電泳遷移率變動分析（RNA-EMSA）進(jìn)一步驗證了該lncKdm2b片段與Satb1的結(jié)合。這些結(jié)果表明lncKdm2b直接結(jié)合ILC3中的Satb1蛋白。

   為了進(jìn)一步確定哪些靶基因受lncKdm2b調(diào)節(jié)，我們進(jìn)行了lncKdm2b^+/+ILC3s與lncKdm2b^-/-ILC3s的轉(zhuǎn)錄組微陣列分析。在十大下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子中，我們關(guān)注的是一種未表征的轉(zhuǎn)錄因子Zfp292，其表達(dá)減少了五倍。我們通過實時定量PCR（RT-qPCR）和免疫印跡驗證了ILC3中Zfp292的下調(diào)。值得注意的是，Zfp292優(yōu)先在ILC3中表達(dá)。我們使用生物素標(biāo)記的lncKdm2b探針通過RNA純化（CHIRP）分析進(jìn)行染色質(zhì)分離。我們發(fā)現(xiàn)lncKdm2b沉積在Zfp292啟動子的特定區(qū)域（nt-1,200至-600）上。此外，我們分離了ILC3（Lin-CD45^loCD90^hi）并進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和DNaseI可及性測定。我們發(fā)現(xiàn)lncKdm2b^-/-ILC3s中Zfp292啟動子的這個區(qū)域（nt-1,200到-600）在組蛋白活性標(biāo)記物Lys4（H3K4me3）的組蛋白H3的三甲基化中富集較少，但對于組蛋白抑制標(biāo)記物H3K27me3更多。因此，lncKdm2b缺失導(dǎo)致Zfp292啟動子上較少的RNA聚合酶II富集，因此對DNaseI消化具有更強的抗性。這些數(shù)據(jù)表明lncKdm2b激活ILC3中的Zfp292表達(dá)。

    我們制備了野生型和lncKdm2b缺陷的LPL裂解物，并將它們應(yīng)用于固定化的抗Satb1用于色譜法。我們通過SDS-PAGE解析洗脫的級分，然后進(jìn)行銀染和質(zhì)譜分析。我們鑒定了lncKdm2b^+/+與lncKdm2b^-/-LPL裂解物中的主要差異條帶，如Bptf和Snf2l，它們是NURF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的一部分?？?/span>-Satb1與lncKdm2b^+/+LPL裂解物中的NURF復(fù)合物共沉淀，但在lncKdm2b^-/-LPL裂解物中不存在。lncKdm2b的加入增強了Satur1和Bptf（NURF復(fù)合物的核心組分）之間的相互作用，而沒有lncKdm2b，Satb1不與Bptf結(jié)合。我們用抗Bptf進(jìn)行了ChIP測定。我們發(fā)現(xiàn)Bptf富集在ILC3中的Zfp292啟動子上。然而，lncKdm2b或Satb1的缺失消除了這種現(xiàn)象。此外EMSA顯示lncKdm2b與Satb1，Bptf和Zfp292啟動子區(qū)域形成復(fù)合物，而用RNaseA和RNaseH處理則消除了該復(fù)合物的形成。因此，Bptf缺失基本上抑制Zfp292表達(dá)，與Satb1缺陷細(xì)胞裂解物中的觀察結(jié)果一致。總之，這些數(shù)據(jù)表明lncKdm2b將Satb1和NURF復(fù)合物募集到Zfp292啟動子上以觸發(fā)其表達(dá)。

    我們通過CRISPR-Cas9方法建立了Zfp292缺陷型小鼠。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，Zfp292缺失顯著降低了ILC3的數(shù)量。此外，Zfp292過表達(dá)恢復(fù)了Zfp292缺失導(dǎo)致的ILC3增殖受損，表明Zfp292是ILC3調(diào)節(jié)所必需的。值得注意的是，Satb1和Bptf的缺失抑制了ILC3的增殖。在Satb1缺陷型和Bptf缺陷型小鼠的腸中，ILC3數(shù)確實減少。與野生型小鼠相比，lncKdm2b^-/-Satb1^-/-Bptf^-/-ILC3中的Zfp292過表達(dá)拯救了ILC3增殖。更重要的是，Zfp292^-/-LPL中的lncKdm2b過表達(dá)不能挽救ILC3增殖，而Zfp292^+/+LPL中的lncKdm2b過表達(dá)確實促進(jìn)了ILC3增殖。因此，Zfp292^-/-小鼠肯定易受C.rodentium感染。最后，與其同窩野生型對照小鼠相比，lncKdm2b^-/-Zfp292^-/-小鼠表現(xiàn)出大大減少的ILC3數(shù)量，以及對細(xì)菌感染的更大易感性。總之，Zfp292在調(diào)節(jié)lncKdm2b介導(dǎo)的ILC3維持中起關(guān)鍵作用。

    在這項研究中，我們證明lncKdm2b在腸ILC3s中以高水平表達(dá)。造血系統(tǒng)中的LncKdm2b敲除導(dǎo)致ILC3的數(shù)量和效應(yīng)功能的減少。此外，我們觀察到lncKdm2b不影響ILC3的發(fā)展，但確實通過促進(jìn)ILC3的增殖來維持ILC3的維持。從機制上講，lncKdm2b將Satb1和NURF復(fù)合物募集到Zfp292啟動子上以啟動其轉(zhuǎn)錄。Zfp292或Bptf的缺失也消除了ILC3的維持，導(dǎo)致對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的易感性。

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