H19 Induces Abdominal Aortic Aneurysm Development and Progression

H19誘導(dǎo)腹主動脈瘤的發(fā)展和進展

期刊：Circulation；影響因子：18.88

發(fā)表單位：德國慕尼黑技術(shù)大學(xué) 

    lncRNA H19是一種新的SMC在AAA發(fā)展和進展中存活的調(diào)節(jié)因子，抑制其表達(dá)可能作為主動脈瘤疾病的新型分子治療靶點。

    lncRNA已成為各種生物過程和疾病中的關(guān)鍵分子調(diào)節(jié)劑。在這里，我們尋求識別和功能表征lncRNAs作為腹主動脈瘤（AAA）發(fā)展的潛在介質(zhì)。在體內(nèi)利用位點特異性反義寡核苷酸（LNA-GapmeRs）對H19進行實驗性敲低，顯著限制了兩種模型中的動脈瘤生長。上調(diào)的H19與進展性動脈瘤中的平滑肌細(xì)胞（SMC）含量和SMC凋亡相關(guān)。H19的體外敲低顯著降低了培養(yǎng)的人主動脈SMC的凋亡率，而H19的過表達(dá)具有相反的作用。定制的轉(zhuǎn)錄因子陣列將缺氧誘導(dǎo)因子1-α（HIF1α）鑒定為主要的下游效應(yīng)子。另外，H19通過將轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1（Sp1）募集到啟動子區(qū)來誘導(dǎo)HIF1α的轉(zhuǎn)錄。

    腹主動脈瘤（AAA）是腹主動脈的局部擴大，直徑大于3厘米，或超過正常大小的1.5倍，死亡率高達(dá)80％。動脈瘤的無癥狀特征使其評估具有挑戰(zhàn)性。不幸的是，到目前為止還沒有確定可以限制其進展或人類破裂風(fēng)險的有效藥理學(xué)方法。臨床上，唯一可用的治療選擇仍然是外科手術(shù)，包括擴張主動脈的開放性或血管內(nèi)主動脈修復(fù)術(shù)（OAR或EVAR）。獲得對驅(qū)動AAA發(fā)展和進展的細(xì)胞機制和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的更好理解對于鑒定新的治療靶標(biāo)是必不可少的。

    我們在血管緊張素II（AngII）/ApoE-/-小鼠模型中進行RNA測序以鑒定動脈瘤發(fā)展期間的失調(diào)。在泵植入后7天收獲來自AngII處理的小鼠（n=4）或假對照（n=4）的腹主動脈組織。當(dāng)使用PPE輸注在第二個實驗性AAA小鼠模型中交叉檢查上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物時，H19和另外兩個lncRNA被鑒定為與模型無關(guān)的lncRNA。通過AngII誘導(dǎo)的AAA樣品中的RT-qPCR與對照相比證實了所有三種lncRNA的上調(diào)，其中H19上調(diào)最顯著（圖1b，c）。利用位點特異性反義寡核苷酸（LNA-GapmeRs）對H19進行全身體內(nèi)敲低顯著限制了兩種鼠模型中的動脈瘤生長（圖1d，e），使用錯配的亂序寡核苷酸作為相關(guān)對照。原位雜交表明H19在未消化的非擴張主動脈的內(nèi)側(cè)SMC和外膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)。在AngII輸注后，H19表達(dá)在擴張的主動脈組織中的內(nèi)側(cè)SMC中顯著升高。通過用GapmeRs抑制H19來消除這種增加。這些數(shù)據(jù)表明H19可能通過影響SMC動力學(xué)參與AAA的發(fā)展和進展。

    與我們的體內(nèi)數(shù)據(jù)一致，AngII能夠在培養(yǎng)的主動脈SMC中穩(wěn)健地誘導(dǎo)H19。AngII處理進一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時降低SMC的增殖率。這些作用均被H19敲低減弱，表明H19在AAA相關(guān)（AngII）條件下對SMC凋亡的調(diào)節(jié)作用。值得注意的是，這種促凋亡作用只能在較晚的時間點（48小時）觀察到，而不是在早期的急性反應(yīng)期（8小時）觀察到。為了進一步評估H19調(diào)節(jié)在SMC中的細(xì)胞效應(yīng)，我們使用了動態(tài)活細(xì)胞成像系統(tǒng)。首先，我們要么用LNA-GapmeRs抑制H19，要么在培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細(xì)胞（hAoSMCs）中用pcDNA-H19依賴性過表達(dá)誘導(dǎo)H19。H19的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增強和SMC的增殖以時間依賴性方式降低。敲除H19抑制SMC凋亡，但未觀察到對增殖率的顯著影響。

    越來越多的研究表明，H19可能作為miR-675的儲庫，其嵌入H19轉(zhuǎn)錄物的第一個外顯子中。因此，我們評估了miR-675在H19介導(dǎo)的對SMC的作用中的作用。 培養(yǎng)的hAoSMC用H19野生型載體（H19wt）或H19突變體轉(zhuǎn)染，缺失miR-675（H19 mut），并隨時間監(jiān)測。H19 mut和H19 wt均誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減少SMC的增殖。除此之外，通過qRT-PCR在AngII誘導(dǎo)的AAA中未觀察到miR-675表達(dá)的顯著差異。與H19不同，miR-675在來自患有AAA的人類患者的組織樣品中或在動脈瘤發(fā)育的兩個實驗鼠模型中的任一個中都沒有顯著失調(diào)。因此，在AAA發(fā)展過程中，H19對SMC的作用似乎與miR-675無關(guān)。

    為了探究H19如何調(diào)節(jié)SMC細(xì)胞凋亡，我們提出H19可能通過轉(zhuǎn)錄因子的改變來影響分子過程。基于對調(diào)節(jié)RNA元件的計算機分析，我們鑒定了包括HIF1α在內(nèi)的幾種預(yù)測與H19相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，然后使用定制設(shè)計的RNA陣列分析顯示HIF1α是唯一的差異調(diào)節(jié)因子。為了證實HIF1α介導(dǎo)H19的作用，我們使用siRNA誘導(dǎo)的HIF1α抑制。HIF1α的mRNA和蛋白質(zhì)水平均被顯著阻斷。有趣的是，H19過表達(dá)以及AngII治療顯著增加了HIF1α的表達(dá)并因此在SMC中凋亡。通過抑制H19或HIF1α沉默可以消除這種作用。在HIF1α抑制后，SMC中的H19水平保持不變。重要的是，促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X（BAX）顯示與HIF1α相同的模式，而抗凋亡介質(zhì)B細(xì)胞CCL/淋巴瘤2（BCL2）顯示相反的趨勢，表明 AngII/H19誘導(dǎo)的SMC凋亡依賴于HIF1α表達(dá)的變化。

    我們用qRT-PCR評估了小鼠和人AAA樣品中HIF1α和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。如所預(yù)期的，H19，HIF1α和BAX均顯著增加，而抗凋亡蛋白BCL2在鼠AngII和PPE模型以及人主動脈瘤中顯著降低。H19的敲低充分抑制了HIF1α的表達(dá)并顯著限制了SMC凋亡。同樣，在人AAA樣品的SMC層中觀察到上調(diào)的H19和HIF1α的共定位以及與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。H19和HIF1α在兩種小鼠AAA模型中一致誘導(dǎo)，而已知HIF1α下游靶標(biāo)的特定變化在不同的AAA模型中不一致，表明這些變化可能與模型相關(guān)而不是HIF1α依賴性。最后，通過PPE灌注在野生型（WT）或Ldlr-/-Yucatan小型豬中誘導(dǎo)AAA，類似于鼠模型。與假手術(shù)組相比，H19的表達(dá)顯著上調(diào)，同時PPE誘導(dǎo)的AAA中HIF1α的表達(dá)增強。

    我們利用原位雜交（ISH）和鄰近連接測定（PLA）評估H19和HIF1α之間的物理相互作用，，其中一旦兩個分子達(dá)到非常接近（<40nm）就可以檢測到放大的信號，這被認(rèn)為是它們相互作用的證據(jù)。事實上，AngII治療以及H19過表達(dá)大大增強了H19和HIF1α之間的相互作用，主要在細(xì)胞質(zhì)中。HIF1α是胚胎心血管發(fā)育所必需的，因此被認(rèn)為是缺氧期間細(xì)胞存活的必要條件。在此過程中，誘導(dǎo)的HIF1α轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并激活參與減少缺氧損傷的許多基因的轉(zhuǎn)錄。氯化鈷（CoCl2）是一種成熟的HIF1α的化學(xué)誘導(dǎo)劑，成功地增加了HIF1α的積累，并觸發(fā)其易位進入細(xì)胞核。有趣的是，H19減弱了易位并將HIF1α滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這表明H19結(jié)合細(xì)胞質(zhì)HIF1α的這種直接相互作用可以刺激SMC凋亡并增強AAA進展。

    我們設(shè)計了生物素標(biāo)記的ISH探針，靶向HIF1α啟動子區(qū)域，并利用基于PLA的相互作用檢測方法在細(xì)胞核中證實了Sp1和H19之間的相互作用模式。然后使用在啟動子區(qū)域含有HIF1α wt或Sp1結(jié)合位點突變體的熒光素酶報告基因測定法。觀察發(fā)現(xiàn)Sp1和H19過表達(dá)的組合處理顯著增加了轉(zhuǎn)錄活性，表明H19募集并促進Sp1與HIF1α啟動子區(qū)域的結(jié)合。在Sp1抑制劑mithramycine A存在下，這些作用被消除，進一步支持Sp1在這種情況下的轉(zhuǎn)錄作用。此外，HIF1α啟動子突變體的熒光素酶測定表明HIF1α啟動子區(qū)域中的兩個Sp1結(jié)合位點對于這些作用是必需的。此外，使用LongTarget工具分析預(yù)測H19-HIF1α結(jié)合模式。H19中該區(qū)域的缺失保留了促凋亡能力，但未能增強HIF1α轉(zhuǎn)錄活性。這些數(shù)據(jù)表明H19通過將Sp1募集到其啟動子區(qū)域來增強HIF1α轉(zhuǎn)錄。最后，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測定能夠證實HIF1α啟動子中Sp1和H19的占據(jù)。

    總之，我們在AAA發(fā)展，其進展和終末期疾病中鑒定了功能相關(guān)的lncRNA。在SMC的細(xì)胞核中，增強的H19與HIF1α的啟動子區(qū)域結(jié)合并募集轉(zhuǎn)錄因子Sp1，其增強HIF1α的表達(dá)。同時，H19與HIF1α蛋白相互作用并將其保留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，作為可阻斷促存活信號傳導(dǎo)的支架。增加的細(xì)胞質(zhì)HIF1α直接與Mdm2相互作用并阻止Mdm2介導(dǎo)的p53減少，從而導(dǎo)致BAX升高和BCL2水平降低。這會引發(fā)SMC凋亡并加速AAA的發(fā)展和進展。

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