PAN-cancer analysis of S-phase enriched lncRNAs identi?es oncogenic drivers and biomarkers

S期富集的lncRNA的泛癌分析鑒定致癌驅(qū)動因子和生物標志物

期刊：Nature Communications；影響因子：12.353 

發(fā)表單位：哥德堡大學(xué) 

    該研究采用新生RNA測序的研究結(jié)合數(shù)據(jù)聚類分析、TCGA數(shù)據(jù)庫與嚴謹?shù)呐R床數(shù)據(jù)調(diào)查，將腫瘤相關(guān)lncRNAs篩選出來，最后提供了一個基于S期相關(guān)的lncRNA中具有潛在預(yù)后價值的致癌因子或腫瘤標志物的綜合性列表。

    本研究提供了基于lncRNA的致癌驅(qū)動因子的綜合列表，具有潛在的預(yù)后價值。在這里，使用新生RNA捕獲測序，我們識別1145個時間表達的S期富集的lncRNA。其中，570個lncRNA在TCGA數(shù)據(jù)集中的至少一種腫瘤類型中顯示出顯著的差異表達。14個Pan-Cancer數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)臨床研究確定了633個獨立的預(yù)后標志物。在幾種癌癥模型中沉默頂部差異表達和臨床相關(guān)的S期富集的lncRNA影響關(guān)鍵的癌細胞標志。SCAT7在多種癌癥類型中的機制研究表明，它與hnRNPK/YBX1復(fù)合物相互作用，并通過調(diào)節(jié)FGF/FGFR及其下游PI3K/AKT和MAPK通路影響癌細胞標志。

    盡管研究lncRNA在癌癥中的作用的研究數(shù)量增加，但我們對癌癥發(fā)生和發(fā)展中lncRNA的理解以及它們與臨床預(yù)后的相關(guān)性尚處于起步階段。在這項研究中，我們提出了兩個基本命題，可以增強當前對lncRNA在癌癥發(fā)展和進展中的關(guān)鍵作用的理解。首先，我們研究S期特異性lncRNA對細胞周期進展和其他重要癌癥相關(guān)標志的貢獻。其次，我們研究了S期特異性lncRNA在不同癌癥中作為獨立預(yù)后生物標志物的能力。為了實現(xiàn)這些目標，我們在S期進展期間采用新生的RNA-seq并產(chǎn)生基于lncRNA的致癌癌驅(qū)動因子的資源，其可用作風(fēng)險評估中的預(yù)后標志物以及癌癥治療中的潛在治療方案。

    使用胸苷和羥基脲使HeLa細胞在G1/S邊界同步，隨后，釋放G1/S阻斷并使細胞在5-乙炔基尿苷（EtU）存在下進行，以便在不同的S期時間點特異性地標記新合成的新生RNA群。我們分別在EtU標記和未標記樣品中獲得1145個具有四種顯著時間表達模式的lncRNA和具有兩種顯著時間模式的937個lncRNA。我們隨機選擇動態(tài)表達的S期lncRNA，并在EtU標記和未標記樣品中跨不同細胞周期階段（G1，S和G2/M）驗證它們的時間表達模式。

我們利用來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的6419種實體瘤和701種正常組織樣品的RNA測序數(shù)據(jù)，這些樣品來自16種癌癥類型。分析顯示，1145個S期特異性lncRNA中的570個在至少一種癌癥類型中差異表達，對數(shù)倍變化±2和錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<1E-004。有趣的是，近73％的差異表達的lncRNA在相應(yīng)的癌癥類型中顯示出上調(diào)。這些觀察結(jié)果表明，這些lncRNAs在多種癌癥中表現(xiàn)出差異表達，并且可以作為理解它們在癌癥發(fā)展和進展中的作用的潛在候選者。

    對570個差異表達的S期lncRNA啟動子進行CpG甲基化分析，發(fā)現(xiàn)35個lncRNA表現(xiàn)出差異甲基化。我們分析了S期lncRNAs的基因-體甲基化，并發(fā)現(xiàn)20個與基因表達相關(guān)的基因體差異甲基化的轉(zhuǎn)錄本。在20個lncRNA中，7個是高甲基化和高度表達的，而13個lncRNA是低甲基化的，在腫瘤中表達較低。對于每種癌癥類型，我們根據(jù)每種lncRNA的表達水平將患者分為高表達組和低表達組。然后，我們使用Kaplan-Meier（KM）方法評估存活率的差異。我們基于二分法的系統(tǒng)分析鑒定了520個S期lncRNA，其預(yù)測存活并且還至少在一種癌癥類型中充當潛在的獨立生物標志物。多變量模型證明KIRC具有最大數(shù)量的基于S期cncRNA的預(yù)后生物標志物。值得注意的是，RP11-59D5__B.2是我們臨床研究的首選候選者，它作為五種癌癥的獨立預(yù)后指標：BLCA，KIRC，KIRP，STAD和HNSC?？傊?，大部分S期lncRNA在不同癌癥類型中顯示出與臨床協(xié)變量相關(guān)的獨立預(yù)后能力。

    為了進一步的功能驗證，我們在TCGA數(shù)據(jù)集中具有較高頻率差異表達的頂級候選者中選擇了8個S期lncRNA，其也獨立地預(yù)測患者在多種癌癥中的存活。此后，我們將所選候選者稱為S期癌癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄物（SCAT）。我們使用HeLa細胞作為模型系統(tǒng)使用小干擾RNA寡核苷酸（siRNA）或鎖定核酸（LNA）反義寡核苷酸耗盡SCAT。我們使用比色MTT測定評估發(fā)現(xiàn)SCAT耗盡誘導(dǎo)顯著影響細胞增殖。使用流式細胞術(shù)評估發(fā)現(xiàn)SCAT的功能喪失誘導(dǎo)細胞周期擾動，伴隨G1期細胞的積累和DNA合成的減少。此外，SCAT的下調(diào)誘導(dǎo)細胞凋亡，如胱天蛋白酶3/7活性的顯著增加所示。

    我們的臨床研究顯示CTD-2357A8.3（SCAT1）和LUCAT1（SCAT5）分別作為肺和腎源性癌癥的常見獨立預(yù)后生物標志物。LUAD和LUSC中SCAT1的較高表達與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。另外，SCAT1顯示同步A549細胞的S期中表達升高。與臨床數(shù)據(jù)一致，A549細胞中SCAT1的下調(diào)表現(xiàn)出對細胞增殖的顯著抑制，G1期細胞周期停滯，并促進細胞凋亡，表明其在肺癌發(fā)生中的作用。類似地，在五種癌癥中差異表達的SCAT5在所有三種類型的腎癌（KIRP，KIRC和KICH）中充當獨立的預(yù)后因子。其較高的表達預(yù)測所有三種癌癥中的不良臨床結(jié)果并且與其他SCAT相似，在Caki-2細胞的S期期間誘導(dǎo)SCAT5表達。 Caki-2細胞中SCAT5的消耗導(dǎo)致細胞增殖減少，G1期細胞周期停滯并誘導(dǎo)細胞凋亡。

    使用siRNA或短發(fā)夾RNA下調(diào)SCAT7的表達，Northern印跡分析中敲低細胞中SCAT7變體的下調(diào)表明我們的RNAi敲低實驗的特異性。Caki-2,786-O，A549，H2228，HepG2和MCF7細胞中SCAT7的下調(diào)影響細胞增殖和細胞周期進展，細胞在G1期優(yōu)先積累。另外，即使在非癌性HEK293細胞中，SCAT7的敲低也導(dǎo)致增殖減少。此外，SCAT7消除改變了多個細胞系中的S期進展，值得注意的是，與其他細胞系相比，H2228細胞中SCAT7的瞬時敲低誘導(dǎo)了G2/M期細胞的顯著積累。我們接下來關(guān)注Caki-2,786-O和A549穩(wěn)定KD細胞系，以闡明SCAT7在細胞凋亡，細胞活力，細胞遷移和侵襲中的功能作用。觀察發(fā)現(xiàn)SCAT7的過表達分別在Caki-2和A549細胞中使細胞增殖增加2.08倍和1.9倍。然而，由于其對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的遺傳抗性，我們無法在786-O細胞系中過表達SCAT7?？偟膩碚f，我們的數(shù)據(jù)證明了SCAT7在調(diào)節(jié)多種癌細胞系中一些最重要的癌癥標志中的關(guān)鍵作用。

    我們使用了兩種成纖維細胞系：BJ和TIG3，用B-RAF轉(zhuǎn)化永生化，使用三種siRNA瞬時下調(diào)SCAT7 72小時誘導(dǎo)兩種細胞系的衰老。然后我們尋求在誘導(dǎo)早衰時評估SCAT7的轉(zhuǎn)錄活性。為此，我們用200nM的4-HT處理BJ-BRAF細胞72小時，并檢查一些衰老相關(guān)標記的轉(zhuǎn)錄激活。有趣的是，過早衰老的開始導(dǎo)致SCAT7表達的顯著降低。另一方面，SCJ7在BJ-BRAF成纖維細胞中的過表達增加了它們的增殖以及關(guān)鍵衰老標記物的轉(zhuǎn)錄活性。過表達SCAT7的細胞能夠繞過他莫昔芬誘導(dǎo)的衰老。我們接下來在SCAT7下調(diào)后對HeLa，A549和Caki-2細胞系進行β-半乳糖苷酶染色。SCAT7的下調(diào)誘導(dǎo)HeLa和A549細胞的衰老表型，而Caki-2細胞保持不受影響。因此，我們的數(shù)據(jù)證明了SCAT7在調(diào)節(jié)細胞衰老中的關(guān)鍵作用，突出了細胞增殖，細胞周期進展和衰老之間的串擾。

    RNA-seq數(shù)據(jù)的后續(xù)功能富集分析顯示，SCAT7的消耗影響了主要的信號傳導(dǎo)通路和重要的生物過程。例如，FGF/FGFR和下游PI3K/AKT和Ras/MAPK通路受到很大影響，同時細胞增殖，細胞粘附，細胞衰老，細胞遷移和凋亡過程也受到干擾。基于RNA-seq分析和隨后跨不同細胞系的驗證，我們假設(shè)SCAT7通過調(diào)節(jié)不同的FGF/FGFR成員來調(diào)節(jié)一些癌癥標志。使用兩種siRNA分別在HeLa和Caki-2細胞中耗盡FGFR2，并且使用A549細胞中的esiRNA分別耗盡FGFR3和FGFR4。有趣的是，FGFR2消耗對細胞周期，細胞增殖和活力的影響表現(xiàn)出SCL7消耗在HeLa和Caki-2細胞中的作用。此外，當FGFR2沉默時，SCAT7誘導(dǎo)的細胞增殖減弱；表明SCAT7誘導(dǎo)的細胞增殖部分地通過FGF/FGFR2信號傳導(dǎo)進行?？傊?，我們的數(shù)據(jù)強烈表明SCAT7通過調(diào)節(jié)FGF/FGFR和下游PI3K/AKT和Ras/MAPK信號傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)和細胞周期進程。

    我們首先確定了SCAT7的亞細胞分布，發(fā)現(xiàn)它在核質(zhì)和染色質(zhì)區(qū)室中富集。然后，我們使用生物素化的寡核苷酸在UV交聯(lián)細胞中進行染色質(zhì)寡聚親和沉淀（ChOP）以下拉SCAT7及其相互作用的蛋白質(zhì)。我們使用RNA免疫沉淀（RIP）測定和ChOP下拉然后Western印跡驗證了hnRNPK和YBX1蛋白與SCAT7的相互作用。我們通過ChIP實驗評估了hnRNPK和YBX1在FGFR2啟動子上的特異性結(jié)合，并且這種結(jié)合在SCAT7下調(diào)后顯著降低。類似地，hnRNPK和YBX1占據(jù)了FGFR3的啟動子區(qū)域，并且它們的結(jié)合在SCAT7下調(diào)后特異性地受到影響。此外，我們觀察到SCAT7耗盡細胞中FGFR編碼區(qū)的RNA聚合酶II占據(jù)率降低。總之，這些觀察結(jié)果表明SCAT7/hnRNPK/YBX1 RNP在不同癌癥模型中的FGFR2和/或FGFR3的轉(zhuǎn)錄激活中起關(guān)鍵作用。

    我們將A549細胞皮下移植到裸鼠體內(nèi)。植入后6周，我們應(yīng)用基于皮下注射兩種獨立的靶向SCAT7的LNA反義寡核苷酸的治療方案，每周兩次。我們在兩次獨立實驗中進行四次注射后測量腫瘤體積，并且與加擾的LNA對照組相比，在SCAT7 LNA組中觀察到40-50％腫瘤生長抑制（TGI）。此外，異種移植物中SCAT7的表達水平與腫瘤體積相關(guān)，并且僅在具有有效SCAT7下調(diào)的腫瘤中觀察到腫瘤生長減少。此外，我們對攜帶KRAS的致癌突變形式的肺轉(zhuǎn)移性患者來源的異種移植物（PDX）小鼠模型在15天內(nèi)實施SCAT7 LNA依賴性治療干預(yù)。注射SCAT7 LNA的PDX小鼠模型顯示出生長速率以及移植腫瘤的體積（約46％）的顯著降低。這些結(jié)果共同表明SCAT7是致癌的lncRNA，并且它可以用作治療不同癌癥的可能的治療靶標。

    總的來說，我們提供了基于lncRNA的致癌驅(qū)動因子的綜合列表，具有潛在的預(yù)后價值。更重要的是，這系統(tǒng)地分析了功能性和臨床相關(guān)的lncRNA可以作為描述lncRNA與腫瘤發(fā)展和進展之間的功能聯(lián)系的資源。

其他相關(guān)文獻解讀

文獻解讀：H19誘導(dǎo)腹主動脈瘤的發(fā)展和進展（IF18.88）

文獻解讀：在人類早期發(fā)育過程lncRNA XACT在控制X染色體活性上與XIST競爭（IF:23.290）

文獻解讀：lncRNA lncKdm2b通過啟動Zfp292表達來持續(xù)維持ILC3細胞(IF:21)

文獻解讀：4個數(shù)據(jù)庫，數(shù)千個RNAseq數(shù)據(jù)分析lncRNA與腫瘤藥物的關(guān)系

文獻解讀：lncRNA Atrolnc-1促進慢性腎病小鼠的肌肉萎縮(IF:12.511)

文獻解讀：cell：lncRNA在終止先天免疫反應(yīng)中的作用（IF:31）

文獻解讀：LncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)節(jié)PKM2信號通路促進結(jié)直腸癌的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移

文獻解讀：TCGA甲基化數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)重要lncRNA