CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells

基于CRISPRi的基因組規(guī)模鑒定人細(xì)胞中功能性長鏈非編碼RNA基因座

期刊：Science；影響因子：41.058

發(fā)表單位：加利福尼亞大學(xué)

    通過使用CRISPRi對多種細(xì)胞系中的lncRNA功能進(jìn)行系統(tǒng)的大規(guī)模篩選，我們鑒定了強(qiáng)大細(xì)胞生長所需的499個lncRNA基因座，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)（89％）lncRNA基因僅在一種細(xì)胞類型中鑒定出改良的生長。

    我們通過開發(fā)CRISPR干擾（CRISPRi）平臺，靶向7個不同細(xì)胞系中的16,401個lncRNA基因座，包括6個轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），大規(guī)模篩選鑒定強(qiáng)大細(xì)胞生長所需的499個lncRNA基因座，其中89％僅在一種細(xì)胞類型中顯示出生長調(diào)節(jié)功能。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)lncRNA敲低可以以細(xì)胞類型特異性方式擾亂復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了許多lncRNA的功能重要性和細(xì)胞類型特異性。

    某些lncRNA在細(xì)胞功能，發(fā)育和疾病中起關(guān)鍵作用，然而只有非常小的部分已經(jīng)建立了生物學(xué)功能， 目前，不可能預(yù)測哪些lncRNA具有功能，更不用說它們執(zhí)行的功能。因此，評估大量lncRNA群功能的大規(guī)模系統(tǒng)方法對于理解這些非編碼轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞生物學(xué)中的作用至關(guān)重要。評估lncRNA功能的系統(tǒng)性努力的中心限制是缺乏用于抑制lncRNA基因活性的高度特異性，可擴(kuò)展的工具。在這里我們增強(qiáng)了之前開發(fā)的CRISPRi的sgRNA文庫，使其更有特異性。

    我們使用設(shè)計(jì)好的sgRNA文庫進(jìn)行lncRNA基因座的篩選，其增加或減少7個細(xì)胞系中每一個的細(xì)胞生長。為了便于在不同持續(xù)時間和具有不同生長速率的細(xì)胞系中進(jìn)行的篩選之間的比較，我們通過總細(xì)胞倍增來標(biāo)準(zhǔn)化sgRNA富集以獲得定量生長表型γ，對生物學(xué)重復(fù)的分析揭示，靶向sgRNA的γ顯示出強(qiáng)的和可再現(xiàn)的表型，而非靶向?qū)φ?/span>sgRNA在0附近緊密分布。我們平均重復(fù)sgRNA表型，并使用它們對lncRNA基因進(jìn)行評分，計(jì)算基因表型來自靶向該基因的前3個sgRNA的平均值和來自所有10個sgRNA的Mann-Whitney p值與非靶向性對照sgRNA的比較。我們從用于下游分析的總命中基因組中去除了不確定的命中后，我們的篩選鑒定了499個lncRNA基因，它們修飾細(xì)胞生長并且沒有必需的編碼基因鄰居，代表了大量未經(jīng)研究的非蛋白質(zhì)編碼基因，它們在細(xì)胞生物學(xué)中起重要作用。

    首先，我們分別克隆了靶向65個代表性lncRNA命中基因座的前兩個sgRNA，其中41個僅在一個細(xì)胞系中命中。我們使用內(nèi)部控制的生長測定法測試了來自篩選的觀察到的表型是否可重復(fù)，其中通過流式細(xì)胞術(shù)隨時間測量用sgRNA感染的細(xì)胞部分。我們監(jiān)測了sgRNA在篩選中表現(xiàn)出表型的細(xì)胞系中的生長效應(yīng)，以及細(xì)胞系中幾種沒有顯示效果的sgRNA，并發(fā)現(xiàn)個體sgRNA生長表型（γ）與篩選γ有很好的相關(guān)性（Pearson r = 0.72）。這證實(shí)了lncRNA敲低表型是可重復(fù)的并且細(xì)胞系之間的lncRNA表型的差異不是由于基因組規(guī)模篩選之間的技術(shù)差異。隨著時間的推移分析這些表型進(jìn)一步揭示了由lncRNA敲低介導(dǎo)的細(xì)胞耗盡的不同動力學(xué)。對于12個lncRNA命中，我們通過qPCR測量敲低水平，發(fā)現(xiàn)盡管有細(xì)胞耗盡的影響，但大多數(shù)靶向轉(zhuǎn)錄物（U87中14/14 sgRNA; MCF7中10/16 sgRNA）的敲除率超過70-95％。

    為了更好地理解lncRNA CRISPRi的后果，我們在3種細(xì)胞類型中對42個lncRNA命中的CRISPRi敲低后進(jìn)行了RNA-seq。這些lncRNA基因座中的32個僅在一種細(xì)胞類型中命中。選擇的lncRNA基因座沒有必需的編碼基因鄰居，并且每個基因的2個或更多個sgRNA被單獨(dú)測試。靶向相同lncRNA TSS的不同sgRNA導(dǎo)致高度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)（平均Pearson r = 0.980），其在層次聚類分析中通常彼此接近。相比之下，靶向具有相同表型方向的不同命中lncRNA基因座的sgRNA對具有更不相似的轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)（平均Pearson r = 0.942，Mann-Whitney p值與相同基因?qū)ο啾?/span>= 6.4×10^-08;），盡管具有相似的表型，但暗示了lncRNA的不同分子機(jī)制。差異基因表達(dá)的RNA-seq分析還揭示了幾個共表達(dá)基因簇，表明生長調(diào)節(jié)劑lncRNA基因座調(diào)節(jié)關(guān)鍵通路。

    為了評估在任何篩選中未顯示為命中的lncRNA基因是真正的陰性還是僅僅是CRISPRi無效抑制的結(jié)果，我們使用每個基因的所有10個sgRNA，我們測量了在任何細(xì)胞中沒有觀察到表型的5個任意選擇的lncRNA基因的敲低，并且在K562和U87細(xì)胞中均表達(dá)。在這100次敲低測量中，61次顯示靶向lncRNA的超過90％的抑制。此外，除了U87細(xì)胞中的LOC100506710之外，所有lncRNA被至少三種不同的sgRNA抑制至少90％。對于所有sgRNA，lncRNA敲低效率與其預(yù)測的CRISPRi活性相關(guān)，并且敲低的效率在K562和U87細(xì)胞之間高度相關(guān)（Pearson r = 0.78）。基于這些發(fā)現(xiàn)，除了少量殘留轉(zhuǎn)錄本足以用于lncRNA功能的情況之外，我們推斷，大多數(shù)沒有出現(xiàn)篩選的lncRNA基因座產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本對于篩選的細(xì)胞系的穩(wěn)健生長不是必需的。

    絕大多數(shù)（89.4％）lncRNA命中僅對一種細(xì)胞類型是獨(dú)特的，沒有一種在5種或更多種細(xì)胞類型中命中。即使當(dāng)我們將該分析限制于在所有7種細(xì)胞類型中表達(dá)的1,329個lncRNA時，82.6％的lncRNA僅在一種細(xì)胞類型中發(fā)生改變的生長?；?/span>Jensen-Shannon距離的細(xì)胞類型特異性評分分析，其量化了給定分布與“完美”特異性的接近程度，揭示了對于lncRNA命中，lncRNA篩選評分的特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于lncRNA表達(dá)的特異性。因此，單獨(dú)的差異表達(dá)模式不足以預(yù)測功能性lncRNA。對于在每種細(xì)胞類型中評分為命中的lncRNA的篩選評分分布的交叉比較揭示了用于調(diào)用命中的閾值未考慮細(xì)胞類型特異性。此外，重復(fù)之間的篩選得分的交叉比較不支持作為表觀細(xì)胞類型特異性功能的來源的技術(shù)變化。

    我們專注于LINC00263，盡管在篩選的所有7種細(xì)胞系中均表達(dá)，但在U87中具有比任何其他細(xì)胞系更強(qiáng)的負(fù)生長表型。在內(nèi)部控制的生長測定中，兩個不同的sgRNA到LINC00263的TSS減少了僅U87細(xì)胞而不是K562，MCF7或HeLa細(xì)胞的增殖。盡管有相同和特異性CRISPRi靶向的證據(jù)，但在LINC00263敲低后，U87和HeLa細(xì)胞具有顯著不同的轉(zhuǎn)錄組變化。值得注意的是，在所有三種細(xì)胞系中，LINC00263的敲低效率是相等的。與我們對LINC00263的觀察一致，敲除PV87和LINC00909（其在U87中但不在HeLa中）在U87中產(chǎn)生了更多差異表達(dá)的基因。相比之下，在U87和HeLa細(xì)胞中均受到影響的LINC00680的耗盡導(dǎo)致U87和HeLa細(xì)胞中差異表達(dá)基因的數(shù)量相當(dāng)。我們的結(jié)果表明，lncRNA功能的特異性不是由于CRISPRi活性的差異，而是與跨細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的差異有關(guān)。

    使用來自我們的基因組規(guī)模篩選的數(shù)據(jù)，我們尋求識別可以將它們與未命中的lncRNA區(qū)分開的lncRNA命中的特性。將來自ENCODE，FANTOM，Vista和其他來源的18類基因組數(shù)據(jù)與本研究中篩選的所有lncRNA基因座進(jìn)行比較。與未命中的lncRNA相比，命中的lncRNA基因體在映射的增強(qiáng)子的1kb內(nèi)的可能性是1.66倍。這代表了我們屏幕中確定的127個lncRNA命中基因座。然而，用于我們分析的FANTOM增強(qiáng)子注釋來自數(shù)百種不同的細(xì)胞類型，因此在我們的篩選中任何給定細(xì)胞類型中只有一小部分這些增強(qiáng)子是活躍的。命中位點(diǎn)也是癌癥相關(guān)SNP的5kb內(nèi)的可能性的1.4倍。我們的命中物富含多外顯子lncRNAs與lncRNA剪接可能是lncRNA功能的一個方面的概念一致。然而，外顯子數(shù)量的解釋力相對較低，我們的屏幕確實(shí)識別了幾個單個外顯子命中，如NEAT1。然而，沒有單獨(dú)或綜合分析的基因組特性完全預(yù)測給定細(xì)胞類型中的生長調(diào)節(jié)劑lncRNA，強(qiáng)調(diào)了執(zhí)行功能喪失篩選以定義功能基因組的重要性。

    無論觀察到的lncRNA的細(xì)胞類型特異性的機(jī)制如何，該發(fā)現(xiàn)對于理解lncRNA的生物學(xué)作用具有意義。LncRNA似乎比蛋白質(zhì)編碼基因起源晚得多，與它們不具有通用的管家角色一致。我們的研究主要關(guān)注強(qiáng)大細(xì)胞生長所需的lncRNA，低估了這些細(xì)胞類型中功能性lncRNA的真實(shí)數(shù)量，因?yàn)橐扬@示lncRNA可調(diào)節(jié)更復(fù)雜的細(xì)胞決定，如細(xì)胞命運(yùn)，癌癥轉(zhuǎn)移和神經(jīng)元功能。這里開發(fā)的CRISPRi工具現(xiàn)在可以應(yīng)用于這種更高級細(xì)胞過程的研究，其中lncRNA可能表現(xiàn)出更大的功能豐富性。最后，lncRNA基因功能的精細(xì)細(xì)胞類型特異性對靶向治療具有明確的意義。

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