MIR100 host gene-encoded lncRNAs regulate cell cycle by modulating the interaction between HuR and its target mRNAs

MIR100宿主基因編碼的lncRNA通過調(diào)節(jié)HuR與其靶mRNA之間的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期

期刊：NUCLEIC ACIDS RESEARCH；影響因子：11.561

發(fā)表單位：伊利諾伊大學(xué)厄巴納香檳分校

    MIR100HG可能作為HuR及其靶mRNA的結(jié)合平臺，從而調(diào)節(jié)HuR和靶mRNA相互作用。

    目前，大多數(shù)lnc-miRHG的細(xì)胞功能尚不清楚。我們證明了核富集的lnc-miRHG在細(xì)胞周期進(jìn)程中的miRNA非依賴性作用。在人體細(xì)胞中消耗MIR100HG編碼的lncRNA導(dǎo)致異常的細(xì)胞周期進(jìn)程，而不改變MIR100HG內(nèi)編碼的miRNA的水平。MIR100HG與HuR/ELAVL1以及幾種HuR靶mRNA相互作用，MIR100HG耗盡的細(xì)胞顯示HuR與其三種靶標(biāo)mRNA之間的相互作用減少，表明MIR100HG促進(jìn)HuR和靶mRNA之間的相互作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)MIRHG編碼的lncRNA在調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白活性中發(fā)揮了新的作用，從而強(qiáng)調(diào)了確定人類基因組中存在的數(shù)百種lnc-miRHG功能的重要性。

    LncRNA基于其基因組位置，表達(dá)模式或功能進(jìn)行細(xì)分。一些lncRNA在其外顯子或內(nèi)含子序列中含有miRNA，因此被稱為miRNA-宿主基因lncRNA（lnc-miRHG）。已經(jīng)充分研究了由lnc-miRHG加工的miRNA的生物發(fā)生和功能。此外，幾種lnc-miRHGs在疾病中表現(xiàn)異常，因此可作為重要的診斷或預(yù)后標(biāo)志物。然而，尚不清楚在miRNA加工過程中從pri-miRHG加工的穩(wěn)定且適當(dāng)剪接的lnc-miRHG池是否具有任何重要的細(xì)胞功能，或僅作為miRNA加工的非功能性副產(chǎn)物。迄今為止很少有研究確定了lnc-miRHG的miRNA非依賴性作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)多個lnc-miRHG，包括MIR100HG，在細(xì)胞周期的特定階段差異表達(dá)。機(jī)制研究表明，MIR100HG促進(jìn)HuR與其靶mRNA的一部分之間的相互作用。

    MIR100HG產(chǎn)生幾種MIR100HG lncRNA的同種型，這是由于選擇性剪接和差異啟動子的使用。為了測試細(xì)胞周期中剪接的MIR100HG的相對水平，我們使用外顯子-外顯子連接引物對在同步的U2OS細(xì)胞的RNA樣品中進(jìn)行RT-qPCR分析以擴(kuò)增外顯區(qū)域由大多數(shù)MIR100HG同種型共有。與我們在pri-miR100HG RNA的情況下觀察到的相似，即使是剪接的MIR100HG也顯示出升高的水平，特別是在G1期間。靶向最后一個外顯子的外顯子引物也顯示相同的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)MIR100HG是主要核和相對穩(wěn)定的lncRNA，半衰期約為75分鐘。通過觀察MIR100HG在正常細(xì)胞與癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)G1期上調(diào)的MIR100HG傾向于在癌細(xì)胞中表現(xiàn)出升高的表達(dá)，并將MIR100HG鑒定為非編碼轉(zhuǎn)錄本。

    為了確定MIR100HG參與細(xì)胞增殖，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞儀分析，發(fā)現(xiàn)MIR100HG耗盡的U2OS細(xì)胞顯示G2/M群體水平升高，同時G1群體減少。使用siRNA耗盡MIR100HG的細(xì)胞也顯示G2/M阻滯而不影響成熟miR-100水平，證實了細(xì)胞周期表型的特異性。最后，我們通過在耗盡內(nèi)源性MIR100HG的細(xì)胞中過表達(dá)全長剪接的MIR100HG同種型來進(jìn)行拯救實驗。我們觀察到MIR100HG cDNA可以部分地拯救G2/M阻滯表型。除G2/M阻滯外，二倍體成纖維細(xì)胞（WI-38）中MIR100HG的消耗也導(dǎo)致S期進(jìn)展缺陷。然后我們在對照和MIR100HG耗盡的U2OS細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組微陣列。我們在MIR100HG耗盡的細(xì)胞中鑒定了722個下調(diào)基因和另外577個上調(diào)基因。分析顯示，這些基因其表達(dá)水平在MIR100HG耗盡的細(xì)胞中發(fā)生改變，在控制細(xì)胞生長的關(guān)鍵通路中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖，細(xì)胞死亡和存活，進(jìn)一步支持在MIR100HG耗盡的細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞表型。

    我們使用生物素標(biāo)記的MIR100HG進(jìn)行了U2OS核提取物的RNA親和力下調(diào)，進(jìn)行了質(zhì)譜分析。然后通過生物素RNA pull-down，免疫印跡測試，證實了MIR100HG和RBP（如HuR，PTB和PUF60）之間的相互作用。HuR可控制多種生物學(xué)事件，包括細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡和癌癥進(jìn)展。因此，我們研究了HuR和MIR100HG之間相互作用的功能意義。我們首先通過細(xì)胞周期同步細(xì)胞提取物中的HuR核糖核蛋白（RNP）免疫沉淀（RIP）分析，然后RT-qPCR證實了HuR與內(nèi)源性MIR100HG之間的相互作用。

    我們進(jìn)行HuR RIP，然后使用來自對照和MIR100HG耗盡的U2OS細(xì)胞的RNA進(jìn)行微陣列。有趣的是，敲除MIR100HG顯著降低了HuR與其幾種靶mRNA的相關(guān)性。此外，通過在對照和MIR100HG耗盡的細(xì)胞中進(jìn)行HuR-RIP，然后進(jìn)行RT-qPCR，我們證實了HuR與其幾種靶mRNA的相關(guān)性降低。同時，MIR100HG消耗不改變HuR與幾種組成型表達(dá)的持家基因mRNA的關(guān)聯(lián)。我們的結(jié)果意味著MIR100HG正向調(diào)節(jié)HuR與其幾種靶mRNA的關(guān)聯(lián)。

    我們使用計算預(yù)測工具來找到與MIR100HG具有序列互補(bǔ)性的mRNA。根據(jù)預(yù)測并通過HuR RIP分析，我們將24個mRNA鑒定為HuR相互作用的mRNA。我們的結(jié)果表明HuR和MIR100HG可以結(jié)合幾種共有的靶mRNA。有趣的是，大多數(shù)預(yù)測mRNA和MIR100HG之間的相互作用是通過MIR100HG最后一個外顯子中存在的第一個富含U的重復(fù)序列發(fā)生的。接下來設(shè)計了一種20nt長的21-O-甲氧基乙基反義寡核苷酸（MOE; MOE-100）來測定U重復(fù)區(qū)域是否對促進(jìn)lncRNA-mRNA相互作用，結(jié)果表明，存在于MIR100HG的3′末端的富含U的序列促進(jìn)其與HuR靶mRNA的特定成員的相互作用。此外，我們還確定了富含U的序列元素是否也促進(jìn)了MIR100HG和HuR之間的相互作用。為此，我們使用生物素標(biāo)記的MIR100HG在細(xì)胞提取物中進(jìn)行RNA親和力pull-down，所述MIR100HG與生物素標(biāo)記的對照（SCR）或富含A的MOE（MOE-100）寡核苷酸預(yù)孵育，然后進(jìn)行免疫印跡。HuR僅在SCR-MOE預(yù)孵育的提取物中顯示出與MIR100HG的強(qiáng)相互作用，而不是在富含A的MOE預(yù)孵育的提取物中，表明MIR100HG利用富含U的基序與HuR和HuR靶mRNA相互作用。

    通常認(rèn)為MIRHG的作用是產(chǎn)生miRNA，并且從MIRHG初級轉(zhuǎn)錄物處理的lncRNA不會發(fā)揮任何重要作用。然而，最近很少有研究報道了由lnc-miRHGs發(fā)揮的miRNA獨立作用。這些研究強(qiáng)調(diào)了這類lncRNA的功能意義，這在以前被忽略，并表明了解MIRHG編碼的lncRNA所起的獨立作用的重要性。我們的研究證明了MIR100HG參與細(xì)胞周期及其在調(diào)節(jié)RBP與其靶mRNA的親和力中的作用，這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了確定數(shù)百種lnc-miRHG在人類基因組中的作用的重要性。

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