Genome-scale Activation Screen Identifies a LncRNA Locus that Regulates a Gene Neighborhood

基因組規(guī)模激活篩選識別調(diào)節(jié)基因鄰域的LncRNA基因座

期刊：Nature；影響因子：41.577

發(fā)表單位：麻省理工學院

    使用基因組規(guī)模篩選的方式可以系統(tǒng)地識別影響特定細胞過程的許多l(xiāng)ncRNA基因座，并促進表征這些基因座的生物學功能。

    我們利用基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9激活篩選發(fā)現(xiàn)了11個新的lncRNA基因座，在募集活化劑后，每個基因座介導BRAF抑制劑對黑色素瘤的抗性。對一種候選物（稱為EMICERI）的詳細分析顯示，其轉(zhuǎn)錄激活導致四種相鄰蛋白質(zhì)編碼基因的劑量依賴性激活，其中一種賦予抗性表型。

    哺乳動物基因組包含數(shù)千個轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA（lncRNA）的基因座，其中一些已知在多種細胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LncRNA基因座可通過多種機制促進細胞調(diào)節(jié)：雖然有些編碼非局部（反式）作用的RNA，但新出現(xiàn)的證據(jù)表明許多l(xiāng)ncRNA基因座在局部（順式）起作用，例如，通過lncRNA啟動子的功能，lncRNA轉(zhuǎn)錄的過程，或lncRNA轉(zhuǎn)錄本身在調(diào)節(jié)附近基因的表達。盡管它們具有潛在的重要作用，但鑒定功能性lncRNA基因座并區(qū)分這些和其他機制仍然具有挑戰(zhàn)性。

    我們以前使用Cas9協(xié)同激活介質(zhì)（SAM）來篩選蛋白質(zhì)編碼基因，這些基因賦予黑素瘤細胞對BRAF抑制劑維羅非尼的抗性，使其成為高通量篩選功能性lncRNA基因座的理想表型。我們設(shè)計了基因組規(guī)模的sgRNA文庫，用于轉(zhuǎn)導A375（BRAF（V600E））黑色素瘤細胞，在2μM 維羅非尼或?qū)φ眨ǘ谆鶃嗧浚?/span>DMSO）中培養(yǎng)，并在藥物處理14天后測序sgRNA的分布。RIGER分析鑒定了16個顯著富集的候選基因座，先前都未在功能上表征。我們在激活具有最強效應的11個基因座中的每一個時進行RNA測序，并且發(fā)現(xiàn)基因表達的全局變化與維羅非尼抗性一致，支持這些基因座與篩選表型的功能相關(guān)性。

    接下來，我們分析這些基因座的激活可能導致抗性的機制，其可包括lncRNA轉(zhuǎn)錄物的非局部功能；lncRNA轉(zhuǎn)錄物的局部功能或其轉(zhuǎn)錄；lncRNA基因座中DNA元件的局部功能；SAM的局部功能四種方式。為了集中于機制可能需要lncRNA或其轉(zhuǎn)錄的基因座，我們激活了每個基因座并檢測到這11個基因座中的6個的穩(wěn)健的lncRNA轉(zhuǎn)錄物上調(diào)。剩余的5個基因座可以通過除了激活lncRNA轉(zhuǎn)錄物之外的機制起作用。

    我們通過隨機慢病毒整合過表達編碼每個lncRNA的cDNA，并且沒有發(fā)現(xiàn)任何影響耐藥性，表明這些位點可能不通過非本地功能起作用。在6個基因座中的5個，我們發(fā)現(xiàn)SAM靶向?qū)е?/span>1到8個附近蛋白質(zhì)編碼基因的差異表達。例如，NR_109890的激活上調(diào)其鄰近基因EBF1，并且TCONS_00015940的激活導致4種相鄰蛋白質(zhì)編碼基因的劑量依賴性上調(diào)。總之，這些分析表明，沒有一個lncRNA基因座似乎通過產(chǎn)生反式作用RNA來賦予維羅非尼抗性；相反，基因座可以調(diào)節(jié)一個或多個附近基因的表達。

    我們發(fā)現(xiàn)TCONS_00015940實際上由兩個單獨的轉(zhuǎn)錄本組成。我們將這些轉(zhuǎn)錄物命名為“EQTN MOB3B IFNK C9orf72增強子RNA I”，或EMICERI和EMICERII。為了確定EMICERI基因鄰域的協(xié)調(diào)上調(diào)如何導致維羅非尼抗性，我們過表達了4種蛋白質(zhì)編碼基因中的每一種的cDNA以及來自隨機整合的慢病毒的EMICERI或II lncRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有MOB3B過表達導致維羅非尼抗性。我們發(fā)現(xiàn)MOB3B過表達下調(diào)LATS1以激活Hippo信號傳導通路。我們將我們的觀察擴展到我們最初篩查的細胞系之外，通過顯示EMICERI和MOB3B的激活在另外兩個敏感的黑素瘤細胞系中賦予了維羅非尼耐藥，并與來自癌癥基因組圖譜的黑素瘤患者維羅非尼耐藥的基因表達特征相關(guān)。總之，這些結(jié)果表明EMICERI基因座的激活通過MOB3B的上調(diào)和隨后的Hippo信號傳導通路的激活賦予了維羅非尼抗性。

    將SAM靶向共享的EMICERI/MOB3B啟動子可能僅通過直接激活MOB3B來賦予抗性。我們使用CRISPR-dCas9、反義寡核苷酸（ASO）轉(zhuǎn)染、攜帶3個串聯(lián)多腺苷酸化信號（pAS）插入的克隆A375細胞系三種擾動方法來干擾EMICERI轉(zhuǎn)錄并觀察對MOB3B的影響，結(jié)果表明EMICERI的轉(zhuǎn)錄是完全激活MOB3B所必需的，證實EMICERI是一種功能性非編碼基因座，其激活四個相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因并有助于篩選表型。接下來我們確定EMICERI轉(zhuǎn)錄本身的功能還是其轉(zhuǎn)錄過程才是MOB3B活化所必需的。我們發(fā)現(xiàn)靶向MOB3B TSS下游的dCas9成功阻斷了MOB3B轉(zhuǎn)錄并降低了EMICERI和其他相鄰基因的表達；類似地，在SAM激活的背景下，靶向MOB3B內(nèi)含子的ASO減少了MOB3B和EMICERI的激活?？傊?，EMICERI和MOB3B擾動實驗表明，lncRNA（EMICERI）和mRNA（MOB3B）的轉(zhuǎn)錄在正反饋機制中相互調(diào)節(jié)，然后可能通過與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一般過程激活更廣泛的基因鄰域。

    理解基因組調(diào)控邏輯的主要挑戰(zhàn)是鑒定功能性lncRNA基因座并表征其機制。在這里，我們證明基因組規(guī)模的激活篩選能夠系統(tǒng)地識別影響特定細胞過程的許多l(xiāng)ncRNA基因座，促進了解這些關(guān)鍵基因座的功能和機制的努力。這種非編碼功能獲取篩查方法在其他環(huán)境中的進一步應用，以及功能喪失篩查方法和我們的表征策略，將有助于闡明這些知之甚少的參與者在發(fā)育和疾病中的復雜作用。

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