circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1ZC3H12A-Dependent Ubiquitination.

circRNA通過HECTD1/ZC3H12A依賴性泛素化介導(dǎo)二氧化硅誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化

期刊：Theranostics；影響因子：8.537

發(fā)表單位：東南大學(xué) 

    ZC3H12A可結(jié)合并穩(wěn)定circHECTD1分子，在SiO2的刺激下，circHECTD1的表達(dá)顯著下降，使得HECTD1得以保留和增高，介導(dǎo)了ZC3H12A的泛素化降解作用，引起巨噬細(xì)胞M1型活化狀態(tài)和肺纖維化等病理進(jìn)程。

    二氧化硅（SiO₂）向肺細(xì)胞的吞噬作用引起炎癥級聯(lián)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖和遷移，隨后出現(xiàn)纖維化。通過研究健康供者和患者以及RAW264.7巨噬細(xì)胞系的肺泡巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)物用于探討circHECTD1（HECT結(jié)構(gòu)域E3泛素蛋白連接酶1）在巨噬細(xì)胞活化中的功能。結(jié)果表明，SiO₂降低了circHECTD1水平，同時增加了HECTD1蛋白表達(dá)；circHECTD1和HECTD1通過泛素化參與SiO₂誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化；SiO₂激活的巨噬細(xì)胞通過circHECTD1/HECTD1通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。

    矽肺病是一種職業(yè)病，由長期暴露于高含量含有過量的游離二氧化硅（結(jié)晶二氧化硅）的粉塵引起，發(fā)病率表現(xiàn)出個體間的差異，這可能是由于個體炎癥反應(yīng)的變化。通過肺泡巨噬細(xì)胞對二氧化硅顆粒的吞噬作用引發(fā)矽肺病。這些巨噬細(xì)胞釋放出各種氧化劑和細(xì)胞因子，它們在疾病的發(fā)展和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，需要研究circRNA在炎癥和纖維化的進(jìn)展和治療中的作用。

    在本研究中，我們對已建立的SiO₂誘導(dǎo)的矽肺小鼠模型進(jìn)行了circRNA微陣列分析。如圖A所示，通過層次聚類顯示，circRNA在生理鹽水（NS）和SiO₂處理的小鼠的肺中表達(dá)。我們鑒定了與NS組相比在SiO₂組中差異表達(dá)的120種circRNA，其中有73個上調(diào)，47個下調(diào)。mmu_circ_0000375特別令人感興趣，因為其宿主基因HECTD1（候選E3泛素連接酶）可能通過遍在蛋白化參與SiO₂誘導(dǎo)的炎癥和纖維化。如圖1B-C中所示的火山和散點圖所示，在NS組和SiO₂組中小鼠的肺中circHECTD1表達(dá)不同。

    肺泡巨噬細(xì)胞（AMO）是矽肺的效應(yīng)細(xì)胞，因此，在小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中測量SiO₂對circHECTD1表達(dá)的影響。通過使用趨異引物的qRT-PCR實驗觀察到在RAW264.7細(xì)胞暴露于SiO₂ 24小時后，circHECTD1表達(dá)降低。這些結(jié)果在熒光原位雜交（FISH）測定中得到證實，其中circHECTD1主要在RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測到。隨后通過檢測SiO₂處理的小鼠BALF分離的巨噬細(xì)胞中的circHECTD1水平證實了circHECTD1表達(dá)的降低。

    將circHECTD1慢病毒轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中使其過表達(dá)，RAW264.7細(xì)胞中circHECTD1的轉(zhuǎn)染恢復(fù)了暴露于SiO₂ 48小時誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的降低。在SiO₂處理的RAW264.7細(xì)胞中測量巨噬細(xì)胞的各種表型標(biāo)志物的水平，例如NOS2（M1），ARG1（M2a）和SOCS3（M2c），發(fā)現(xiàn)SiO₂誘導(dǎo)NOS2，ARG2和SOCS3表達(dá)的顯著增加。用circHECTD1慢病毒轉(zhuǎn)染減弱了用SiO₂處理的巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，消除了SiO₂誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞遷移的增加，證實了circHECTD1在SiO₂誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化中的作用。

    之前已表明ZC3H12A/MCPIP1可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和成纖維細(xì)胞增殖/遷移，尚不清楚circHECTD1是否可以介導(dǎo)ZC3H12A影響巨噬細(xì)胞活化。ZC3H12A質(zhì)粒減弱了由SiO₂誘導(dǎo)的M1和M2標(biāo)記物的增加，而ZC3H12A siRNA加劇了由SiO₂誘導(dǎo)的M1和M2標(biāo)記物的增加。此外，我們采用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）測定來確定circHECTD1和ZC3H12A之間是否存在相關(guān)性，結(jié)果表明ZC3H12A與circHECTD1相互作用但不與HECTD1 mRNA相互作用。

    我們首先檢測在SiO₂處理的RAW264.7細(xì)胞中HECTD1蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)快速且持續(xù)的增加，免疫染色證實了這一發(fā)現(xiàn)。此外，HECTD1 mRNA的水平顯示出快速和瞬時的增加并且在SiO₂暴露后3小時達(dá)到峰值。隨后我們建立小鼠矽肺模型，免疫組織化學(xué)分析揭示了肺中巨噬細(xì)胞的積累，如特異性巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80的增加所示，表明發(fā)生了炎癥級聯(lián)反應(yīng)。在SiO₂暴露后HECTD1表達(dá)在小鼠肺中上調(diào)，并且HECTD1與巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80的共定位也增加，證實了先前的發(fā)現(xiàn)。

    用circHECTD1慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞不影響HECTD1 mRNA水平但卻抑制了HECTD1蛋白的表達(dá)，突出了circHECTD1和HECTD1之間的聯(lián)系?；?/span>CRISPR/Cas9系統(tǒng)，用HECTD1 CRISPR激活質(zhì)粒（ACT）轉(zhuǎn)染和用CRISPR雙切口酶質(zhì)粒（NIC）轉(zhuǎn)染分別上調(diào)和下調(diào)HECTD1的表達(dá)。ACT增加ARG1和SOCS3的表達(dá)但不增加NOS2，而NIC增加NOS2表達(dá)并降低ARG1和SOCS3的表達(dá)，HECTD1被認(rèn)為參與由SiO₂誘導(dǎo)的circHECTD1介導(dǎo)的表型變化。ACT治療也降低了RAW264.7細(xì)胞的活力，而NIC治療恢復(fù)了它們的生存能力。

    免疫沉淀測定揭示了HECTD1和ZC3H12A之間的相互作用。通過檢測蛋白酶體抑制劑MG-132對ZC3H12A的作用，發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞的存活率以劑量依賴性方式降低。此外，ZC3H12A表達(dá)在生理暴露于MG-132后升高，但在SiO₂處理后未升高。隨后，檢測HECTD1對K48-遍在蛋白表達(dá)的影響。HECTD1的過表達(dá)增強了K48-遍在蛋白的表達(dá)。HECTD1敲低減弱了K48-遍在蛋白的表達(dá)，而對ZC3H12A表達(dá)的作用與K48-遍在蛋白的作用相反。此外，circHECTD1慢病毒的轉(zhuǎn)染降低了K48-遍在蛋白的表達(dá)。

    接下來，我們將存在或不存在ACT或NIC處理（條件培養(yǎng)基）的暴露于SiO₂的RAW264.7細(xì)胞的上清液應(yīng)用于成纖維細(xì)胞，并測量成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。來自NIC處理的RAW264.7細(xì)胞的上清液顯著抑制SiO₂誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，而來自ACT處理的RAW264.7細(xì)胞的上清液增加細(xì)胞遷移。此外，在存在或不存在ACT或NIC（條件培養(yǎng)基）的情況下生長的正常生理RAW264.7細(xì)胞的上清液對成纖維細(xì)胞遷移發(fā)揮相同的作用。來自NIC處理的RAW264.7細(xì)胞的上清液引起對SiO₂誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化的顯著抑制，而來自ACT處理的RAW264.7細(xì)胞的上清液引起成纖維細(xì)胞活化增加。

    我們對臨床矽肺患者的檢查證實了我們的發(fā)現(xiàn)，與來自健康供體的患者相比，來自矽肺患者的BALF的巨噬細(xì)胞中HECTD1水平顯著增加。此外，我們觀察到HECTD1與矽肺患者的肺組織中的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80之間的共定位。基于這些結(jié)果，來自矽肺患者的巨噬細(xì)胞顯示HECTD1水平增加并且經(jīng)歷細(xì)胞凋亡和活化，從而促進(jìn)矽肺病的發(fā)展。

    circRNA是廣泛表達(dá)的非編碼RNA非常穩(wěn)定，但是circRNA的功能知之甚少。在這里，我們的研究闡明了SiO₂誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化與circHECTD1/HECTD1通路之間的聯(lián)系，從而為HECTD1在開發(fā)治療矽肺的新治療策略中的潛在用途提供了新的見解。

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