CRISPRi-based genome-scale identification of functional long non-coding RNA loci in human cells

基于CRISPRi的基因組規(guī)模鑒定人細胞中功能性長鏈非編碼RNA基因座

期刊：Science；影響因子：41.058

發(fā)表單位：加利福尼亞大學

    通過使用CRISPRi對多種細胞系中的lncRNA功能進行系統(tǒng)的大規(guī)模篩選，我們鑒定了強大細胞生長所需的499個lncRNA基因座，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)（89％）lncRNA基因僅在一種細胞類型中鑒定出改良的生長。

    我們通過開發(fā)CRISPR干擾（CRISPRi）平臺，靶向7個不同細胞系中的16,401個lncRNA基因座，包括6個轉化細胞系和人誘導多能干細胞（iPSC），大規(guī)模篩選鑒定強大細胞生長所需的499個lncRNA基因座，其中89％僅在一種細胞類型中顯示出生長調節(jié)功能。我們進一步發(fā)現(xiàn)lncRNA敲低可以以細胞類型特異性方式擾亂復雜的轉錄網(wǎng)絡。這些數(shù)據(jù)強調了許多lncRNA的功能重要性和細胞類型特異性。

    某些lncRNA在細胞功能，發(fā)育和疾病中起關鍵作用，然而只有非常小的部分已經(jīng)建立了生物學功能， 目前，不可能預測哪些lncRNA具有功能，更不用說它們執(zhí)行的功能。因此，評估大量lncRNA群功能的大規(guī)模系統(tǒng)方法對于理解這些非編碼轉錄本在細胞生物學中的作用至關重要。評估lncRNA功能的系統(tǒng)性努力的中心限制是缺乏用于抑制lncRNA基因活性的高度特異性，可擴展的工具。在這里我們增強了之前開發(fā)的CRISPRi的sgRNA文庫，使其更有特異性。

    我們使用設計好的sgRNA文庫進行lncRNA基因座的篩選，其增加或減少7個細胞系中每一個的細胞生長。為了便于在不同持續(xù)時間和具有不同生長速率的細胞系中進行的篩選之間的比較，我們通過總細胞倍增來標準化sgRNA富集以獲得定量生長表型γ，對生物學重復的分析揭示，靶向sgRNA的γ顯示出強的和可再現(xiàn)的表型，而非靶向對照sgRNA在0附近緊密分布。我們平均重復sgRNA表型，并使用它們對lncRNA基因進行評分，計算基因表型來自靶向該基因的前3個sgRNA的平均值和來自所有10個sgRNA的Mann-Whitney p值與非靶向性對照sgRNA的比較。我們從用于下游分析的總命中基因組中去除了不確定的命中后，我們的篩選鑒定了499個lncRNA基因，它們修飾細胞生長并且沒有必需的編碼基因鄰居，代表了大量未經(jīng)研究的非蛋白質編碼基因，它們在細胞生物學中起重要作用。

    首先，我們分別克隆了靶向65個代表性lncRNA命中基因座的前兩個sgRNA，其中41個僅在一個細胞系中命中。我們使用內部控制的生長測定法測試了來自篩選的觀察到的表型是否可重復，其中通過流式細胞術隨時間測量用sgRNA感染的細胞部分。我們監(jiān)測了sgRNA在篩選中表現(xiàn)出表型的細胞系中的生長效應，以及細胞系中幾種沒有顯示效果的sgRNA，并發(fā)現(xiàn)個體sgRNA生長表型（γ）與篩選γ有很好的相關性（Pearson r = 0.72）。這證實了lncRNA敲低表型是可重復的并且細胞系之間的lncRNA表型的差異不是由于基因組規(guī)模篩選之間的技術差異。隨著時間的推移分析這些表型進一步揭示了由lncRNA敲低介導的細胞耗盡的不同動力學。對于12個lncRNA命中，我們通過qPCR測量敲低水平，發(fā)現(xiàn)盡管有細胞耗盡的影響，但大多數(shù)靶向轉錄物（U87中14/14 sgRNA; MCF7中10/16 sgRNA）的敲除率超過70-95％。

    為了更好地理解lncRNA CRISPRi的后果，我們在3種細胞類型中對42個lncRNA命中的CRISPRi敲低后進行了RNA-seq。這些lncRNA基因座中的32個僅在一種細胞類型中命中。選擇的lncRNA基因座沒有必需的編碼基因鄰居，并且每個基因的2個或更多個sgRNA被單獨測試。靶向相同lncRNA TSS的不同sgRNA導致高度相關的轉錄組反應（平均Pearson r = 0.980），其在層次聚類分析中通常彼此接近。相比之下，靶向具有相同表型方向的不同命中lncRNA基因座的sgRNA對具有更不相似的轉錄組反應（平均Pearson r = 0.942，Mann-Whitney p值與相同基因對相比= 6.4×10^-08;），盡管具有相似的表型，但暗示了lncRNA的不同分子機制。差異基因表達的RNA-seq分析還揭示了幾個共表達基因簇，表明生長調節(jié)劑lncRNA基因座調節(jié)關鍵通路。

    為了評估在任何篩選中未顯示為命中的lncRNA基因是真正的陰性還是僅僅是CRISPRi無效抑制的結果，我們使用每個基因的所有10個sgRNA，我們測量了在任何細胞中沒有觀察到表型的5個任意選擇的lncRNA基因的敲低，并且在K562和U87細胞中均表達。在這100次敲低測量中，61次顯示靶向lncRNA的超過90％的抑制。此外，除了U87細胞中的LOC100506710之外，所有lncRNA被至少三種不同的sgRNA抑制至少90％。對于所有sgRNA，lncRNA敲低效率與其預測的CRISPRi活性相關，并且敲低的效率在K562和U87細胞之間高度相關（Pearson r = 0.78）。基于這些發(fā)現(xiàn)，除了少量殘留轉錄本足以用于lncRNA功能的情況之外，我們推斷，大多數(shù)沒有出現(xiàn)篩選的lncRNA基因座產(chǎn)生的轉錄本對于篩選的細胞系的穩(wěn)健生長不是必需的。

    絕大多數(shù)（89.4％）lncRNA命中僅對一種細胞類型是獨特的，沒有一種在5種或更多種細胞類型中命中。即使當我們將該分析限制于在所有7種細胞類型中表達的1,329個lncRNA時，82.6％的lncRNA僅在一種細胞類型中發(fā)生改變的生長?；?/span>Jensen-Shannon距離的細胞類型特異性評分分析，其量化了給定分布與“完美”特異性的接近程度，揭示了對于lncRNA命中，lncRNA篩選評分的特異性遠遠大于lncRNA表達的特異性。因此，單獨的差異表達模式不足以預測功能性lncRNA。對于在每種細胞類型中評分為命中的lncRNA的篩選評分分布的交叉比較揭示了用于調用命中的閾值未考慮細胞類型特異性。此外，重復之間的篩選得分的交叉比較不支持作為表觀細胞類型特異性功能的來源的技術變化。

    我們專注于LINC00263，盡管在篩選的所有7種細胞系中均表達，但在U87中具有比任何其他細胞系更強的負生長表型。在內部控制的生長測定中，兩個不同的sgRNA到LINC00263的TSS減少了僅U87細胞而不是K562，MCF7或HeLa細胞的增殖。盡管有相同和特異性CRISPRi靶向的證據(jù)，但在LINC00263敲低后，U87和HeLa細胞具有顯著不同的轉錄組變化。值得注意的是，在所有三種細胞系中，LINC00263的敲低效率是相等的。與我們對LINC00263的觀察一致，敲除PV87和LINC00909（其在U87中但不在HeLa中）在U87中產(chǎn)生了更多差異表達的基因。相比之下，在U87和HeLa細胞中均受到影響的LINC00680的耗盡導致U87和HeLa細胞中差異表達基因的數(shù)量相當。我們的結果表明，lncRNA功能的特異性不是由于CRISPRi活性的差異，而是與跨細胞類型的轉錄網(wǎng)絡的差異有關。

    使用來自我們的基因組規(guī)模篩選的數(shù)據(jù)，我們尋求識別可以將它們與未命中的lncRNA區(qū)分開的lncRNA命中的特性。將來自ENCODE，FANTOM，Vista和其他來源的18類基因組數(shù)據(jù)與本研究中篩選的所有lncRNA基因座進行比較。與未命中的lncRNA相比，命中的lncRNA基因體在映射的增強子的1kb內的可能性是1.66倍。這代表了我們屏幕中確定的127個lncRNA命中基因座。然而，用于我們分析的FANTOM增強子注釋來自數(shù)百種不同的細胞類型，因此在我們的篩選中任何給定細胞類型中只有一小部分這些增強子是活躍的。命中位點也是癌癥相關SNP的5kb內的可能性的1.4倍。我們的命中物富含多外顯子lncRNAs與lncRNA剪接可能是lncRNA功能的一個方面的概念一致。然而，外顯子數(shù)量的解釋力相對較低，我們的屏幕確實識別了幾個單個外顯子命中，如NEAT1。然而，沒有單獨或綜合分析的基因組特性完全預測給定細胞類型中的生長調節(jié)劑lncRNA，強調了執(zhí)行功能喪失篩選以定義功能基因組的重要性。

    無論觀察到的lncRNA的細胞類型特異性的機制如何，該發(fā)現(xiàn)對于理解lncRNA的生物學作用具有意義。LncRNA似乎比蛋白質編碼基因起源晚得多，與它們不具有通用的管家角色一致。我們的研究主要關注強大細胞生長所需的lncRNA，低估了這些細胞類型中功能性lncRNA的真實數(shù)量，因為已顯示lncRNA可調節(jié)更復雜的細胞決定，如細胞命運，癌癥轉移和神經(jīng)元功能。這里開發(fā)的CRISPRi工具現(xiàn)在可以應用于這種更高級細胞過程的研究，其中lncRNA可能表現(xiàn)出更大的功能豐富性。最后，lncRNA基因功能的精細細胞類型特異性對靶向治療具有明確的意義。

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